Vorbereitung der Maus Pituitary Immunogen für die Induktion der experimentellen autoimmunen Hypophysitis

Die autoimmune Hypophysitis ist gekennzeichnet durch eine Vergrößerung der Hypophyse und einen Mangel an einem oder mehreren Hypophysenhormonen. Die ursächlichen Autoantigene sind weiterhin unbekannt. Hier wird ein Protokoll zur Herstellung von Maus-Hypophysenproteinen zur Untersuchung dieser Erkrankung vorgestellt.

Zunächst werden Hypophysen von euthanasierten Mäusen isoliert. Anschließend werden die Hypophysen homogenisiert, um die Zellen mechanisch zu zerstören und zytoplasmatische Proteine freizusetzen. Das Homogenat wird durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit geklärt und hinsichtlich der Menge mittels kolorimetrischem BCA-Assay sowie hinsichtlich der Qualität durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert.

Schließlich wird der wässrige Proteinhomogenat mit einem öligem Adjuvans vermischt. Diese Mischung wird anschließend in Mäuse injiziert, um ein Mausmodell zu erzeugen, das einer autoimmunen Hypophysitis ähnelt. Wie im begleitenden Video gezeigt, wurden vier Techniken zur Induktion einer Hypophysitis bei Versuchstieren beschrieben.

Die in diesem Artikel vorgestellte Technik, bei der ein Gemisch von Hypophysenproteinen mit Influenza-Adjuvans injiziert wird, ist die älteste und stammt aus den 1960er Jahren. Andere Ansätze waren die Injektion löslicher Glykoproteine des Rötelnvirus im Jahr 1992, die stereotaktische Injektion eines Adenovirus direkt in die Hypophyse im Jahr 2002 sowie die Transplantation einer Hypophyse von einer Rattenstamm unter die Nierenkapsel eines anderen Rattenstamms im Jahr 2010. Der Hauptvorteil des Verfahrens mit Florenz-Adjuvans liegt darin, dass es heutzutage weniger invasiv ist, konsistenter und vor allem genauer bei der Induktion einer Erkrankung, die der menschlichen Erkrankung eng ähnelt.

Obwohl die Fremdadjuvanztechnik bereits seit den 1960er Jahren beschrieben wurde, erwies sie sich als wenig wirksam zur Induktion einer Hypophysitis. Als ich meine Doktorarbeit begann, konnte ich mit dem veröffentlichten Fremdadjuvanzprotokoll nur eine geringe Inzidenz und Schwere einer Hypophysitis erzielen. Die Situation verbesserte sich signifikant, als mir die Idee kam, die Menge an Hypophysenproteinen im EM-Emulsion um das Zehnfache zu erhöhen.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Pathogenese der autoimmunen Hypophysitis ermöglichen kann, lässt sie sich auch zur Untersuchung anderer Autoimmunerkrankungen anwenden, bei denen die Autoantigene noch nicht identifiziert wurden. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, vor allem bei dem letzten Schritt, der Herstellung des Randes, Schwierigkeiten, da dieser manuelle Geschicklichkeit, Zeit und Engagement erfordert. Eine visuelle Demonstration ist daher entscheidend, um zu verstehen, wie eine geeignete Emulsion hergestellt werden sollte.

Die Bedeutung dieser Technik reicht über den Bereich der Autoimmunität hinaus. Die Kenntnis der Herstellung des Antigens für die Immunisierung kann auch bei der Produktion monoklonaler Antikörper oder beim Testen neuer Impfstoffe genutzt werden. Diese Technik wird von S. Zoo Heroic Ura und Mayland al Gato aus meinem Labor demonstriert.

Die Maushypophyse ist eine zylindrisch geformte Drüse, die an der Schädelbasis in einer Vertiefung des Keilbeins liegt, die als Sella turcica bezeichnet wird. Die Drüse wird seitlich von den Nervi trigemini und anterior vom Chiasma opticum begrenzt. Sie besteht aus einem größeren vorderen Lappen sowie kleineren mittleren und hinteren Lappen.

Um die Hypophyse zu isolieren, den euthanasierten Mäuserücken mit einer Schere abtrennen und dann parallele Schnitte von der Rückseite zur Vorderseite des Schädels führen. Das Gehirn anheben und nach hinten umklappen, um die Hypophyse freizulegen, die als Zylinder im Kontext eines gleichschenkligen Dreiecks erscheint. Die Hypophyse bildet dabei die Basis, die Nervi trigemini die Seiten und die Chiasma optica den Scheitelpunkt.

Umkreisen Sie die Drüse mit den Spitzen geschlossener Pinzetten, um die umgebende Hirnhaut zu durchtrennen. Fassen Sie dann mit einer feinen Pinzette die Hypophyse aus der Zelle von Turca und legen Sie sie in ein Plastikröhrchen auf Trockeneis. Sammeln Sie für eine Präparation 300 Hypophysen von Mäusen.

Diese Sammlung erfordert ungefähr neun Personenstunden. Sobald die Sammlung abgeschlossen ist, lagern Sie die Hypophysen bei minus 80 Grad Celsius, bis sie benötigt werden. Stellen Sie ein 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen in ein Eisbad.

Fügen Sie dem Reagenzglas 250 Mikroliter Homogenisierungspuffer hinzu. Geben Sie für jeweils 100 kurz vor der Homogenisierung gesammelte Hypophysen die Hypophysendrüsen der Maus in den Puffer. Anschließend platzieren Sie die Spitze des Polytron-Homogenisators, einen Generator mit fünf Millimeter Durchmesser, auf den Boden des Falcon-Röhrchens, das die Hypophysen der Maus und den Puffer enthält, und homogenisieren 30 Sekunden lang mit maximaler Geschwindigkeit.

Vorsichtiges Bewegen des Röhrchens auf und ab, während es weiterhin auf Eis gehalten wird. Anschließend das Homogenat eine Minute lang auf Eis ruhen lassen. Die Homogenisierung und Abkühlung noch zweimal wiederholen.

Diese schonende Homogenisierung sollte die Zellen zerstören und die Proteine freisetzen, ohne die Kerne zu zerstören. Zentrifugieren Sie das Homogenat bei niedriger Geschwindigkeit, etwa 1000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um die Kerne, nicht aufgelöstes Gewebe sowie unlösliche Materialien wie Bindegewebe und denaturierte Protein-Komplexe zu sedimentieren. Achten Sie darauf, den Pellet nicht aufzuwirbeln.

Überführen Sie das SNA, das nun als postnukleäres Homogenat oder PNS bezeichnet wird, in ein neues Falcon-Röhrchen. Bewahren Sie das PNS auf Eis auf, resuspendieren Sie das Pellet mit dem gleichen Volumen Puffer für die Homogenisierung wie zuvor, homogenisieren und zentrifugieren Sie erneut wie zuvor. Nach dem Vereinen der beiden PNS-Proben pipettieren Sie die Lösung in mehrere Mikrozentrifugenröhrchen.

Lagern Sie die Mikrozentrifugenröhrchen bei minus 80 Grad Celsius, bis sie benötigt werden. Diese Proteinpräparation ist bei minus 80 Grad Celsius stabil, verliert jedoch allmählich ihre Wirksamkeit. Daher wird empfohlen, sie innerhalb von sechs Monaten nach der Herstellung zu verwenden.

Behalten Sie eine kleine Aliquotprobe des PNS zurück, um die Proteinmenge und -konzentration mittels der Biuret-Reaktion zu bestimmen. Anschließend wird die Proteinqualität durch Gelelektrophorese aus 300 Maushypophysen überprüft, die ein durchschnittliches Gesamtgewicht von etwa 570 Milligramm aufweisen. Erwarten Sie eine Ausbeute von 60 Milligramm Hypophysenproteinen, also ein Milligramm Protein pro 10 Milligramm Gewebe.

Die Protein-Konzentration liegt typischerweise bei etwa 40 Milligramm pro Milliliter. Das hier dargestellte Beispiel dient der Immunisierung von 10 Mäusen. Planen Sie ein, jede Maus mit 100 Mikrolitern Emulsion zu injizieren, die ein Milligramm Hypophysenprotein enthält. Um Materialverluste während der Vorbereitung einzuplanen, werden hier für zwei zusätzliche Mäuse 12 Milligramm Proteinemulsion hergestellt.

Beginnen Sie mit dem schnellen Auftauen der gefrorenen Proteinportionen, indem Sie diese in den Händen erwärmen. Stellen Sie die Protein-Konzentration mit PBS auf 20 Milligramm pro Milliliter ein. Ziehen Sie anschließend 600 Mikroliter des Hypophysen-Proteinextrakts, entsprechend 12 Milligramm, in eine 2,5-Milliliter-Gas-Tite-Hamilton-Spritze auf und resuspendieren Sie den kompletten FRONS-Adjuvans oder CFA, der fünf Milligramm pro Milliliter hitzeabgetötetes Mycobacterium tuberculosis enthält, durch manuelles Schütteln.

Ziehen Sie anschließend 600 Mikroliter der CFA in eine weitere 2,5-Milliliter-Hamilton-Spritze auf. Bringen Sie eine 22-Gauge-Mikroemulgier-Nadel an der mit CFA gefüllten Spritze an und befestigen Sie sie sicher. Drücken Sie langsam den Kolben, sodass die Nadel mit CFA gefüllt wird.

Befestigen und sichern Sie dann das andere Ende der Nadel an der anderen Spritze, die mit Hypophysen-Proteinextrakt gefüllt ist. Vermeiden Sie es, Luftblasen in den Spritzen einzuschließen. Bewegen Sie langsam den Kolben der CFA-Spritze, um die Ölkomponente in den wässrigen Hypophysen-Extrakt zu drücken, sodass nur eine geringe Menge vermischt wird.

Danach den Kolben der Hypophysenextrakt-Spritze in die CFA-Spritze zurückschieben. Diesen Vorgang wiederholen, um schrittweise die Menge des gemischten Materials zu erhöhen, bis der gesamte Inhalt vermischt ist. Dieses weißliche und gleichmäßig verteilte Material stellt die Wasser-Öl-Emulsion dar.

Einmal gebildet, den kompletten Hin- und Herbewegungszyklus mindestens 500 Mal wiederholen. Nach dem letzten Zyklus enthalten die Spritzen eine Emulsion aus Wasser und Öl im Verhältnis eins zu eins, bei der die Hypophysenproteinkonzentration nun 10 Milligramm pro Milliliter beträgt. Die Emulsion ist gebrauchsfertig; um die Qualität der Emulsion zu prüfen, einen Tropfen davon in ein Becherglas mit Wasser geben. Falls die Emulsion korrekt hergestellt wurde, bleibt der Tropfen auf der Oberfläche kompakt und zusammengehalten.

Wenn die Emulsion von schlechter Qualität ist, breitet sie sich aus und zerfällt in kleinere Tröpfchen. Die Emulsion wird am selben Tag ihrer Herstellung in SJL-Mäuse injiziert, um eine experimentelle autoimmune Hypophysitis auszulösen. Dieses Protokoll ist in der begleitenden JoVE-Ausgabe detailliert beschrieben.

Nachdem die Hypophyse gesammelt wurde und die Techniken beherrscht sind, kann man die Proteinisierung innerhalb einer Stunde durchführen, wobei man daran denken sollte, schnell und auf Eis zu arbeiten. Während dieses Schritts, während der Vorbereitung der Einweichung, die ungefähr eine Stunde erfordert. Denken Sie daran, in der anfänglichen Mischphase langsam und geduldig zu arbeiten, nach ihrer Entwicklung.

Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Autoimmunität, um die Mechanismen zu untersuchen, durch die autoreaktive Lymphozyten das Zielorgan erkennen und infiltrieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen Proteinauszug aus der Hypophyse der Maus herstellt und wie man ihn mit Crohn's aju ones mischt, um eine Emulsion herzustellen, die als Immunogen verwendet werden kann. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Spritzen und complete flu edge ones, die inaktiviertes und trockenes mikrobakterielles Tuberkulose enthalten, gefährlich sein kann, wenn Sie sich versehentlich verletzen.

Verwenden Sie daher immer G-Glows und entsorgen Sie die Nadeln ordnungsgemäß, während Sie diesen Vorgang durchführen.