Bestimmen Zellzahl während der Zellkultur mit dem Scepter Cell Counter

Der Scepter-Zellzähler ist ein handgehaltenes, automatisiertes Gerät zur Zählung von Zellen, Überwachung des Zelldurchmessers und -volumens sowie Beurteilung der Gesundheit und Qualität zellulärer Populationen. Er bietet erhebliche Vorteile gegenüber anderen Zählmethoden, darunter verbesserte Genauigkeit, einfache Handhabung und geringe Kosten für die Zellzählung. Verwenden Sie den Scepter und folgen Sie den Anweisungen auf dem grafischen Display, um die Zellen in den Einweg-Sensor anzusaugen.

Die Zellen werden dann gezählt, und das Gerät meldet Zellkonzentrationen und Statistiken, die auf einen Computer hochgeladen und analysiert werden können. Hallo, ich bin Sonya. Ich bin Wissenschaftlerin hier bei Millport, und heute zeige ich Ihnen, wie man den Scepter verwendet.

Zellzähler Die Zählung von Zellen ist ein notwendiger, aber zeitraubender Schritt in der Zellkultur in vitro. Konsistente Zellkonzentrationen gewährleisten die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit von Experimenten. Zellzählungen sind wichtig, um den Zellzustand und die Proliferationsrate zu überwachen, immortale oder transformierte Zellen für nachfolgende Experimente, Transfektionen oder Infektionen auszusäen und sich auf zellbasierte Assays vorzubereiten, trotz der Notwendigkeit von Schnelligkeit und Genauigkeit.

Bei der Zellzählung zählen 71 % der befragten 400 Forscher Zellen mithilfe eines Hämozytometers. Obwohl die Hämozytometrie kostengünstig ist, ist sie arbeitsaufwendig und anfällig für Benutzerfehler und Fehlanwendungen, was zu ungenauen Zählungen führt. Zu den Fehlerquellen bei der Hämozytometrie gehören eine ungleichmäßige Zellverteilung in der Probe sowie zu viele oder zu wenige Zellen in der Probe.

Subjektive Entscheidungen darüber, ob eine bestimmte Zelle innerhalb des definierten Zählbereichs liegt. Kontamination des Hämozytometers, Benutzervariabilität und Variation der Füllgeschwindigkeit des Hämozytometers, um die Langeweile, die mit der manuellen Zählung verbunden ist, zu verringern. 29 % der Forscher zählen Zellen mithilfe automatisierter Zellzählgeräte.

Doch für die meisten Forscher stellt der Preis dieser großen Laborgeräte eine Hürde für ihre Nutzung dar. Der Scepter-Zellzähler ist ein automatisiertes, handgehaltenes Gerät, das die Automatisierung und Genauigkeit der Coulter-Zählung zu relativ geringen Kosten in einem benutzerfreundlichen, handlichen Format bietet. Das System verwendet das Coulter-Prinzip der impedanzbasierten Partikelerkennung in miniaturisierter Form und kombiniert analoge und digitale Hardware zur Signalerfassung, Signalverarbeitung, Datenspeicherung und grafischen Anzeige.

Der Einweg-Sensor ist mit einer mikrofabrizierten Zellmesszone konstruiert, die eine Unterscheidung nach Zellgröße und Zellvolumen mit submikronaler und subpikoliter Auflösung ermöglicht und durch präzise Flüssigkeitskanäle sowie Elektronik verbessert wird. Der Scepter-Zellzähler zeigt die Statistiken der Zellpopulation grafisch als Histogramm zur Nutzung an. Der Scepter-Zellzähler beginnt damit, eine Einzelzell-Suspension von Zellen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung zu verdünnen.

Eine Konzentration von 10.000 bis 500.000 Zellen pro Milliliter ist optimal. Überführen Sie 100 Mikroliter verdünnte Zellen in ein 1,5-Milliliter-Microview-Röhrchen. Schalten Sie den Scepter-Zellzähler ein, indem Sie den Schalter auf der Rückseite des Geräts gedrückt halten, und warten Sie, bis die Anweisungen auf dem Bildschirm erscheinen.

Wenn dazu aufgefordert, befestigen Sie einen Sensor am Ende der Scepter-Einheit, wobei die elektrodenbasierte Sensierfläche in Richtung der Vorderseite des Instruments zeigt. Scepter-Sensoren bestehen aus einer präzise geformten Probenkammer mit einer elektronischen Sensierzone und integrierten Zellsensorelektroden. Die Sensoren ermöglichen es, die Zellgröße mit submikronaler Auflösung und das Zellvolumen mit subpikoliter Auflösung zu unterscheiden.

Eine konsistente Sensor-Technik stellt sicher, dass gleiche Probenvolumina gezählt und genaue Größenmessungen durchgeführt werden. Sobald der Sensor angebracht ist, führen Sie jeden Schritt des Zählprozesses gemäß der Bildschirmanweisungen wie folgt durch. Wenn auf dem Bildschirm angezeigt wird, halten Sie den Kolben gedrückt, um den Kolben zu betätigen. Anschließend zeigt der Bildschirm tauchen Sie den Sensor ein. Tauchen Sie den Sensor in die Zellsuspensionslösung ein und lassen Sie den Kolben los, um die Zellsuspension in den Sensor zu aspirieren.

Der Kolben wirkt als elektrisches Signal und zieht die Probe zusammen mit dem Totvolumen in den Sensor ein. Die Geschwindigkeit oder Genauigkeit des Kolbenhubes ist nicht entscheidend, im Gegensatz zum Pipettieren. Dieser Vorgang dauert mehrere Sekunden, sobald er bereit ist.

Das Gerät gibt einen Ton von sich und die eingebrachte Probe wird auf dem Bildschirm angezeigt. Sobald die Probe in den Sensor eingebracht ist, wird sie durch die Messzone gezogen, um Zellgröße und Zellvolumen zu bestimmen. Anschließend gelangt sie durch die Mikrokanäle; wenn 50 Mikroliter der Probe gezählt wurden, signalisiert der Sensor dem Gerät, die Zählung zu stoppen.

Nach Abschluss der Zählung zeigt der Gerätebildschirm „Zählung abgeschlossen“ an. Bitte entfernen und entsorgen Sie den Sensor. Befolgen Sie die Aufforderung und nehmen Sie den Sensor heraus und entsorgen Sie ihn.

Das Gerät zeigt dann ein Histogramm der Zellgröße oder des Zell­durch­messers auf seinem Bild­schirm sowie die Zell­konzentration pro Milliliter an. Sobald die Zählung abgeschlossen ist und das Histogramm auf dem Gerät angezeigt wird, setzen Sie Tore, indem Sie die Umschalt­taste drücken, und wählen Sie automatische Torgestaltung („auto gating“) oder die letzte Einstellung („use last“), um entweder automatisch ein Tor basierend auf dem Histogrammprofil festzulegen oder die Tore der vorherigen Zählung zu übernehmen. Unabhängig von der Auswahl können die Tore manuell angepasst werden, um sie fein zu justieren.

Stellen Sie die Daten ein, drücken Sie erneut die Umschalttaste, um das linke Tor auszuwählen, und scrollen Sie mit der Umschalttaste, um das Tor nach Belieben zu verschieben. Drücken Sie dann erneut die Umschalttaste, um das rechte Tor zu aktivieren, und scrollen Sie, um das rechte Tor zu positionieren. Klicken Sie erneut.

Eine neue Zellkonzentration, durchschnittliches Zellvolumen und Durchmesser werden angezeigt. Der Schalter kann auch auf beiden Seiten betätigt werden, um zwischen Datum/Uhrzeit, mittlerer Zellgröße und mittlerem Zellvolumen umzuschalten. Bis zu 72 Histogramme können direkt am Gerät gespeichert werden. Um die Daten auf einen Personalcomputer hochzuladen, schließen Sie das Gerät über den USB-Anschluss an und verwenden Sie den Anzeigeschirm am PC.

Doppelklicken Sie auf die Scepter-Softwareanwendung, um die Software zu starten. Klicken Sie anschließend auf „Verbinden“. Alle Zählwerte werden automatisch in die Software übertragen.

Die Scepter-Anwendungssoftware zeigt das Histogramm an, das die Populationsverteilung der Kultur entweder nach Volumen oder Durchmesser detailliert darstellt. Heruntergeladene Dateien können anschließend in Microsoft Excel exportiert werden, wobei die Rohdaten in Klassen spezifischer Zelldurchmesser oder Zellvolumina angezeigt werden. 19 verschiedene Zelllinien wurden zur Zählung vorbereitet, und die theoretischen Startkonzentrationen wurden mithilfe eines Zellzählgeräts bestimmt.

Diese Zellsuspensionen wurden anschließend weiter verdünnt, um Zellsuspensionen mit theoretischen Zellkonzentrationen zu erhalten. Anschließend wurde der Scepter-Zellzähler verwendet, um die Zellkonzentrationen zu bestimmen. Diese Abbildung zeigt fünf Verdünnungen, die für fünf repräsentative Zelllinien gemessen wurden, zusammen mit der theoretischen Zellkonzentration.

Der hohe Grad der Linearität, angegeben durch die Bestimmtheitsmaße (r-Quadrat-Werte), zeigt, dass die Scepter-Zählung eine zuverlässige Methode für die getesteten Zelllinien über einen breiten linearen Arbeitsbereich hinweg darstellt. Die gesamte relative Genauigkeit der Scepter-Zählung wird hier gezeigt, wobei Daten aus der Scepter-Zählung mit Zählungen aus der Coter-Zählung verglichen werden. Der Logarithmus der Scepter-Zellzahlen wird gegen den Logarithmus der Coter-Zahlen aufgetragen und zeigt, dass die Scepter-Zahlen über alle getesteten Zelllinien hinweg mit den Coter-Zahlen übereinstimmen.

Zählungen von 19 Zelllinien wurden mit einem Zwei-Kanal-Coulter-Zähler durchgeführt. Die Zählung mit dem Scepter-Zellzähler, einem automatisierten, bildbasierten Zähler wie dem V-Zell- oder Count-Test-System, sowie die Hemo-TER-Zählungen wurden gemäß den Herstelleranweisungen unter Verwendung derselben anfänglichen Zellsuspension und identischer Verdünnungen durchgeführt. Die in dieser Abbildung gezeigten Ergebnisse zeigen, dass die mittels Scepter-Zählung bestimmten Zellkonzentrationen eng mit den theoretischen Zellkonzentrationen übereinstimmen und eine hohe Linearität aufweisen.

Der prozentuale Variationskoeffizient oder CV wurde für jede Verdünnung jeder Zelllinie berechnet. Für jedes hier gezeigte Zählverfahren sind die durchschnittlichen prozentualen CVs über 19 Zelllinien bezüglich Zellkonzentration und Zählmethode innerhalb des Arbeitsbereichs angegeben. Der Scepter-Zellzähler ist präziser als die Zählung mit dem Hämozytometer und weist geringere Standardabweichungen sowie kleinere durchschnittliche Variationskoeffizienten auf.

Die Scepter-Zählung ist zehnmal schneller als die Hämocytometrie und ebenfalls schneller als andere automatisierte Zähler. Hier wurden SF-nine-, MCF-seven- und HC-2-93-Zellen mit den in diesem Video beschriebenen Methoden gezählt. Die durchschnittliche Zeit, die zur Messung der Zellkonzentration benötigt wurde, wurde aufgezeichnet.

Beachten Sie, dass die Hämocytometrie nur einmal pro Probe durchgeführt wurde. Der Scepter führt Messungen basierend auf der Zellgröße durch. Daher können alle Veränderungen in der zellulären Morphologie im Histogramm erfasst werden.

Gesunde Kulturen zeigen eine klare glockenförmige Gauß-Verteilung, während ungesunde Zellen sterben und eine Verschiebung des Histogramms nach links verursachen. Ebenso wurden Histogrammverschiebungen beobachtet, wenn eine Population aus 50 % toten Zellen mit 50 % lebenden Zellen gemischt wurde. Ich habe Ihnen gerade gezeigt, wie man den neuen Scepter-Zellzähler von Millipore verwendet, der die Art und Weise, wie Forscher ihre Zellen zählen, revolutioniert.