Mikrofabrizierten Plattformen für Mechanisch Dynamische Cell Culture

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Vorrichtungen zur mechanischen Stimulation von Zellen in zwei- und dreidimensionalen Kulturgegebenheiten mikrotechnisch herzustellen. Dies wird durch eine mehrschichtige Sandwich-Form- und Stapeltechnik erreicht, mit der ein Array vertikal angesteuerter Mikrosäulen erzeugt wird. In einem zweiten Schritt wird das Array aus vertikal angesteuerten Mikrosäulen modifiziert, um einen Kulturfilm zu dehnen, wodurch gut kontrollierte Dehnungen auf Zellen ausgeübt werden, die auf dem Film kultiviert werden.

Alternativ kann das Array modifiziert werden, um mikrostrukturierte Biomaterialkonstrukte zu komprimieren und dadurch mechanische Reize auf Zellen auszuüben. Die Kultivierung in einem Array aus dreidimensionalen Hydrogelen führt zu Ergebnissen, die anhand der Bildanalyse fluoreszierender Markierungspunkte die gleichzeitige Anwendung einer Bandbreite zweidimensionaler, echokardiographisch biaxialer und dreidimensionaler Kompressionsdehnungen über das gesamte Array hinweg zeigen. Hallo, ich bin Chris Mariahs aus den Laboren von Craig Simmons und U Sun am Department für Maschinenbau und Industrietechnik sowie am Institut für Biomaterialien und Biomedizinische Technik an der University of Toronto.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Herstellung mikroskopischer Vorrichtungen, die zur mechanischen Stimulation von Zellen verwendet werden. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um zu untersuchen, wie Zellen in der in-vitro-Kultur auf eine Vielzahl mechanischer Kräfte reagieren. Beginnen wir also.

Der Prozess der Sandwich-Formherstellung umfasst das Auflegen einer Overhead-Folie auf ungehärtetes polydimethylsiloxan oder PDMS auf einem SU-8-Master. Der Sandwich wird in einen Stapel aus Schaumglas und Metall gelegt und im Ofen unter Druck gehärtet. Schließlich wird der Stapel auseinandergenommen und die Folie abgezogen, wobei die strukturierte PDMS-Schicht zurückbleibt.

Zur Durchführung dieses Verfahrens mischen Sie PDMS, Monomer und Vernetzer gründlich. Tragen Sie im üblichen Verhältnis von 10 zu 1 drei Milliliter der ungehärteten PDMS-Mischung auf eine zuvor hergestellte SU-8-Masterform und DGAs auf, und polymerisieren Sie das Polymer in einer Vakuumkammer. Anschließend platzieren Sie das Schaumstoffpad und die SU-8-Masterform auf einer Grundplatte aus Plexiglas.

Senken Sie die glatte Seite einer Tintenstrahl-Transparenz vorsichtig auf das ungehärtete PDMS ab und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen eingeschlossen werden. Positionieren Sie dann einen silanisierten Objektträger auf der Transparenz unter dem zweiten Schaumstoffpad und einer Plexiglasschutzplatte. Klemmen Sie das Sandwich mit einem C-Schraubstock zusammen.

Den PDMS-Sandwich in einem Ofen bei 80 Grad Celsius mindestens vier Stunden aushärten lassen. Nach dem Aushärten den Sandwich aus dem Ofen nehmen und abkühlen lassen. Nach dem Abkühlen die Klammer entfernen und den Sandwich auseinanderbauen.

Lösen Sie die Transparentfolie vorsichtig von dem SU-8-Master unter Beibehaltung der strukturierten PDMS-Folie. Schneiden Sie die Ränder der Musterfolie zurecht, um überschüssiges PDMS zu entfernen, und lagern Sie die Musterebenen bis zur Verwendung in einer staubfreien Umgebung. Der nächste Abschnitt dieses Protokolls beschreibt den Aufbau eines mikrofabrizierten Arrays aus vertikal bewegten Säulen.

Um das Array aus Mikropfosten herzustellen, ist ein mehrschichtiger Herstellungsprozess erforderlich. Die unterste strukturierte PDMS-Schicht wird mittels Sandwich-Formherstellung vorbereitet. Für diese Experimente wurden kreisförmige Muster mit Durchmessern zwischen 600 und 1.200 Mikrometern verwendet.

Um die PDMS-Schicht auf einen sauberen Objektträger zu übertragen, behandeln Sie die PDMS- und Glasoberflächen mit einem Corona-Entladungsgerät mittels Sauerstoffplasma. Bringen Sie danach die beiden Oberflächen in Kontakt miteinander. Stellen Sie den Stapel 10 Minuten lang auf eine Heizplatte bei 80 Grad Celsius, um den Bindungsprozess abzuschließen.

Entfernen Sie die Transparenzfolie und entsorgen Sie sie. Dieser Prozess stellt sicher, dass der strukturierte PDMS-Film niemals von einem starren Substrat gelöst wird, wodurch eine Schrumpfung der einzelnen Schichten verhindert wird. Die zweite gegossene Sandwich-Schicht wird als Negativabdruckform der gewünschten Membran- und Säulenstruktur gebildet.

In dieser Demonstration wurden kreisförmige Säulen mit einem Durchmesser von 500 µm verwendet, um diese Schicht herzustellen. Befestigen Sie zunächst die negative Abformform vorübergehend mit doppelseitigem Klebeband an einem Objektträger und silanisieren Sie sie in einer Vakuumtrockenschrank. Tragen Sie anschließend nicht ausgehärtetes PDMS auf das Sandwich, die Formschicht, auf, entgasen und streichen Sie es 45 Sekunden lang bei 1000 Umdrehungen pro Minute ab, wodurch eine 60 µm dicke Aktuationsmembran entsteht. Härten Sie die spin-beschichtete PDMS-Schicht anschließend etwa 20 Minuten lang bei 80 °C teilweise aus, oder bis das PDMS klebrig ist, sich aber nicht dauerhaft verformt, wenn man es berührt. Entfernen Sie danach den Objektträger und das doppelseitige Klebeband von der teilweise ausgehärteten PDMS-Schicht sowie die Transparenzfolie, befestigen Sie sie an einem Paar von Glas-Handhabungsobjektträgern und behandeln Sie sie mit Plasma.

Behandeln Sie das teilweise gehärtete PDMS, drehen Sie es dann um und legen Sie es in einen speziell angefertigten Ausrichter. Der Ausrichter besteht aus einer Vakuumspannvorrichtung, die auf einem Mikromanipulator montiert ist. Behandeln Sie anschließend die erste PDMS-Schicht im Plasma, und platzieren Sie sie auf einer Drehtischplatte unterhalb der Vakuumspannvorrichtung.

Beobachten Sie die Ausrichtung zwischen den beiden Schichten mit einem maschinellen Sehsystem mit 12-facher Vergrößerung. Richten Sie mithilfe des Manipulators die Schichten aus und bringen Sie sie vorsichtig in Kontakt. Üben Sie mit dem Finger leichtem Druck aus, um die Schichten zusammenzufügen.

Entfernen Sie dann das Sandwich aus dem Aligner. Entfernen Sie die Glas-Handhabungsfolien und stellen Sie sicher, dass die Schichten vollständig miteinander in Kontakt sind. Aushärten im Ofen bei 80 Grad Celsius für zusätzliche 30 Minuten.

Nach 30 Minuten können die transparente und siloisierte PDMS-Abformung vom Gerät abgezogen und entsorgt werden. Das Gerät wird anschließend bei 80 Grad Celsius mindestens vier Stunden lang vollständig ausgehärtet, um Experimente mit Zellen durchzuführen, die auf einem verformbaren zweidimensionalen Substrat kultiviert wurden. Das Mikroaktor-Array wird modifiziert, indem eine dritte PDMS-Schicht mit dem Gerät verbunden wird.

Die dritte PDMS-Schicht besteht aus einer zweischichtigen Struktur. Der untere Kreis entspricht der Größe des Aktivierungshohlraums unterhalb der betätigten Mikropfosten. Der Durchmesser des oberen Kreises ist 100 Mikrometer größer als der Durchmesser der Belastungspfosten.

Ein 200 Mikrometer breiter Mikrokanal verbindet diese Strukturen mit einem Anschlussbereich und dient zur Schmierung der Ladekontakte und der Kulturschicht. Um das Gerät für die 2D-Kultur umzurüsten, fertigen und binden Sie zunächst die Anschlüsse entsprechend der schriftlichen Anleitung an das Gerät. Anschließend beschichten Sie die glatte Seite einer Transparentfolie durch Schleuderbeschichtung mit einer 10 bis 15 Mikrometer dicken PDMS-Schicht und härten diese.

Die dünne PDMS-Schicht bei 80 Grad Celsius mindestens vier Stunden lang. Im nächsten Schritt wird ein Vakuum an die Aktuatoren angelegt und die PDMS-Schicht mit dem Gerät verbunden. Um dies zu erreichen.

Zunächst wird ein schwacher Vakuumdruck auf die Aktuatoren angelegt, um die Säulenmatrix abzusenken, einer Plasma-Behandlung zu unterziehen und zu verbinden. Der spin-coatierte PDMS-Film wird gemäß dem schriftlichen Protokoll auf das aktivierte Mikrogerät aufgebracht; die Säulen und der Kulturfilm verbleiben für kurze Zeit hydrophil. Anschließend wird die Schmierflüssigkeitsspritze an das Gerät angeschlossen und die Schmierkanäle mit einer 90 %igen Glycerinlösung in entionisiertem Wasser gefüllt.

Zusätzlich zur Schmierung bewahrt diese Formulierung die Hydrophilizität des PDMS unbegrenzt und verringert so die Reibungskoeffizienten. Stellen Sie das Gerät auf eine Heizplatte bei 40 Grad Celsius und fahren Sie fort, Schmiermittel in den Kanal einzuspritzen, wodurch ein leichter Druckanstieg verursacht wird. Nach einigen Minuten verteilen sich die Luftblasen durch das PDMS, und alle Oberflächen werden geschmiert.

Entfernen Sie im letzten Schritt den Unterdruck, indem Sie die Säulen mit einem Skalpell lösen. Schneiden Sie entlang des dünnen PDMS-Films. Ziehen Sie die Transparenzfolie vorsichtig von der plasma-bondierten Vorrichtung ab.

Eine manuell ausgeschnittene PDMS-Dichtung um den Kulturbereich des Geräts. Sterilisieren Sie das Gerät, indem Sie es fünf Minuten lang in 70 %igem Ethanol einweichen und anschließend 45 Minuten lang einer keimabtötenden UV-Bestrahlung in einem biologischen Sicherheitswerkbank unterziehen. Plasma-besiedeln Sie die Oberfläche und inkubieren sie über Nacht bei vier Grad Celsius mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Kollagen.

Nach einer Übernacht-Inkubation das Gerät mit steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS waschen und Zellen mit einer Dichte von 10.000 bis 15.000 Zellen pro Quadratzentimeter ansäen. Gemäß standardmäßiger Zellkultivierungsprotokolle kann das Mikroaktor-Array modifiziert werden, um Experimente mit in dreidimensionalen, lichtmusterbasierten Hydrogel-Konstrukten kultivierten Zellen durchzuführen. Zunächst wird eine mehrschichtige, PDMS-basierte Plattform hergestellt.

Nachdem die Basisplattform mit einem Meth bedeckt wurde, wird eine verwandte Glas-Deckglas-Hydrogel-Vorläuferlösung injiziert. Anschließend wird ein photopolymerisierbares Biomaterial in das Array mikropatterniert und die übrige Vorläuferlösung wird abgespült. Das Array vertikal beweglicher Belastungsstifte kann dann verwendet werden, um kompressive mechanische Kräfte auf in dreidimensionalen Biomaterialien kultivierte Zellen auszuüben, wobei Bereiche um die Stifte herum mit Klebeband abgedeckt werden, um das Gerät in einem PDS 2010 Lab COTER Two-System mit Paraline C zu beschichten.

Dies verbessert die Polymerisationskinetik für das Biomaterialsystem. Nach dem Beschichten das Gerät aus dem Beschichtungssystem nehmen und das Klebeband abziehen, wodurch eine konforme Schicht aus Paraline C auf den Säulen zurückbleibt. Anschließend die Meth-ACRL-Glasdecken mit einer 2 %igen (Volumen pro Volumen) Lösung von drei Trimethoxypropylmethacrylat in 95 %igem Ethanol für zwei Minuten behandeln.

Spülen Sie die Abdeckung. Geben Sie 100 % Ethanol hinzu, anschließend Trocknung bei 100 Grad Celsius, wodurch Methacrylatgruppen auf der Oberfläche verbleiben. Gießen Sie einen 200 µm dicken PDMS-Abstandshalter.

Folie in eine Petrischale legen und in kleine Abschnitte schneiden. Vier dieser kleinen Abschnitte mit Plasmabehandlung am Rand des Meac-bezogenen Deckgläschens befestigen. Anschließend die Zwischenräume mit den PDMS-Bereichen des Geräts, die die Lene C-beschichtete Fläche bedecken, durch Plasmabehandlung verbinden.

Den Apparat abschließend durch Waschen in 70 % Ethanol sterilisieren und 45 Minuten lang einem Desinfektionsmittel oder UV-Licht in einem biologischen Sicherheitswerkbank aussetzen. Um die zellbeladenen PEG-Hydrogels mittels Fotolithographie in den Apparaten zu strukturieren, bereiten Sie das Vorläufer- und das Photoinitiator-Lösungsmittel gemäß der schriftlichen Anleitung vor und mischen Sie diese gründlich, um eine Lösung mit einer Konzentration von 0,4 % Gewicht pro Volumen an Photoinitiator zu erhalten.

Filtrieren Sie die Mischung durch einen 0,45-Mikron-Spritzenfilter, um sie zu sterilisieren und Partikel, Trypsin und Eisenzellkulturen zu entfernen, und stellen Sie eine Zellsuspension in Kulturmedium mit der doppelten gewünschten Endzellkonzentration her. Anschließend mischen Sie die Zellsuspension und die gefilterte Hydrogel-Vorläufer-Photoinitiatorlösung im Verhältnis 1:1. Injizieren Sie die Lösung mit einer langen 25-Gauge-Nadel in das Mikrogerät.

Vermeiden Sie sorgfältig das Einschließen von Blasen im Gerät. Richten Sie eine ausgedruckte Transparenzmaske an den Ausrichtungsmarkierungen auf der Geräteoberfläche aus. Richten Sie ein UV-Beleuchtungssystem so ein, dass es an der Geräteoberfläche eine UV-Dosis mit einer Wellenlänge von 365 Nanometern und einer Intensität von 17,5 Milliwatt pro Quadratzentimeter bereitstellt.

Belichten Sie das Hydrogel durch die Maske für 195 Sekunden nach der Belichtung. Spülen Sie die nicht polymerisierte Hydrogel-Vorläuferlösung mit PBS ab und ersetzen Sie den PBS durch Kulturmedium. Aktivieren Sie die Belastungsstifte, um die Hydrogel-Konstrukte zu komprimieren. Hier ist ein fertiges Beispielgerät für die 2D-mechanostimulative Kultur dargestellt.

Rot gefärbte Flüssigkeit wird verwendet, um die Druckaktivierungs-Kanäle zu markieren, und blau gefärbte Flüssigkeit dient zur Markierung der Schmierkanäle für die Dehnungscharakterisierung. Experimente können durchgeführt werden, um die aufgebrachten Dehnungsfelder zu bestimmen, indem die Bewegung fluoreszierender Kügelchen auf den Substraten verfolgt wird. Rote Punkte stellen die ursprüngliche Position der Kügelchen dar, während grüne Punkte die verformten Positionen anzeigen.

Hier ist eine Beispielvorrichtung für dreidimensionale Kompressionsversuche zu sehen, bei der grüne Farbe verwendet wird, um die Druckkanäle für die Aktuierung zu markieren. Die Draufsicht auf das Mikrosäulen-Array zeigt das Hydrogel-Konstrukt, das auf der Oberseite des Säulenfeldes angeordnet ist, sowie rekonstruierte Seitenansichten fluoreszierender Kügelchen im Hydrogel-Konstrukt. Die Darstellung unter Ruhebedingungen und bei einer Aktuierungsdruckbelastung von 55 Kilopascal veranschaulicht den Dehnungscharakterisierungsprozess in einem dreidimensionalen Kultursystem.

Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man Vorrichtungen herstellt, die zur mechanischen Stimulation von Zellen in zweidimensionalen oder dreidimensionalen Kultursystemen verwendet werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass die Vorrichtungen so sauber und staubfrei wie möglich gehalten werden, und Geduld zu bewahren, insbesondere während der Ausrichtungsschritte. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.