Methoden für die experimentelle Manipulationen nach Optic Nerve Durchtrennung im Säuger-ZNS

Retinalganglienzellen oder RGcs sind Neuronen des zentralen Nervensystems, die visuelle Informationen von der Netzhaut über den Sehnerv an das Gehirn weiterleiten. In dem begleitenden Video wurde eine Methode zur ex-sodomitischen oder zum Durchtrennen der Axone der gesamten RGc-Population als Modell für apoptotischen neuronalen Zelltod im adulten zentralen Nervensystem demonstriert. Hier wird diese Methode mit Verfahren kombiniert, die direkt neurotrophen Faktoren, kurze interferierende RNAs, Plasmide oder virale Vektoren, die anti-ATO-Proteine kodieren, verletzten Retinalganglienzellen oder der Netzhaut zur gezielten Beeinflussung der Netzhaut im Gesamten zuführen.

Ein Injektionsapparat für intraokulare Injektionen wird zusammengestellt und verwendet, um Substanzen in die Glaskörperhöhle des Auges zu injizieren, um gezielt retinale Ganglienzellen anzusprechen. Entweder wird Gelfoam platziert oder eine Hamilton-Spritze verwendet, um Substanzen in den Sehnerv zu injizieren. Die Bildgebung der Nervenstümpfe zeigt, dass das Überleben retinaler Ganglienzellen durch die Zufuhr anti-apoptotischer Faktoren erhöht werden kann.

Mithilfe dieser Techniken kann diese Methode verwendet werden, um Proteine zu identifizieren, die an der Apoptose von adulten Neuronen im zentralen Nervensystem beteiligt sind. Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie oder Diagnose von Erkrankungen des zentralen Nervensystems, da der Sehnervdurchtrennungsversuch ein reproduzierbares Modell für die neuronale Apoptose im adulten ZNS darstellt. Im Allgemeinen haben Anfänger Schwierigkeiten mit dieser Technik, da sie die Linse beschädigen, wenn sie die Glaspipette in die Glaskörperhöhle des Auges einführen. Um das Spritzen-System für intrazelluläre Injektionen vorzubereiten, entfernen Sie zunächst jede Nadel oder RN-Mutter.

Verwenden Sie eine 10-Mikroliter-Gastdichtspritze des Typs 1701 von Hamilton. Führen Sie das PFA-Feral in das Peak-Cup-Feral der Kompressionsverschraubung ein. Setzen Sie anschließend die komplette Verschraubung in das Ende der Spritze ein und schrauben Sie die RN-Mutter locker darüber.

Stecken Sie ein Ende eines 1/16-Zoll-Peak-Schlauchs in die Kompressionsverschraubung durch die Öffnung in der RN-Mutter. Stellen Sie sicher, dass der Peak-Schlauch vollständig eingesetzt ist. Ziehen Sie die RN-Mutter fest, um die Dichtung zu komprimieren, wodurch der Peak-Schlauch abgedichtet wird.

Wiederholen Sie diesen Vorgang an beiden Enden des dualen RN-Glaskopplers. Befestigen Sie das freie Ende des Spitzenrohrs an einem Ende des dualen RN-Glaskopplers, indem Sie die RN-Mutter festziehen. Die Glasmikropipette bildet die Nadel und die Hülse für das Injektionssystem.

Fügen Sie die Glaspipette in das freie Ende des doppelten RN-Glasverbinders ein. Ziehen Sie die RN-Mutter fest, um die Pipette zu befestigen. Erzeugen Sie unter einem Stereomikroskop eine Öffnung mit dem geeigneten Durchmesser, indem Sie eine gezogene Mikropipette schräg halten und die Spitze an der mattierten Glasoberfläche eines Objektträgers entlangreiben, um einen Bruch zu erzeugen.

Die Endspitze sollte idealerweise leicht abgeschrägt sein. Als Nächstes ein Priming-Kit der Hamilton Syringe Company verwenden, das mit Spritze, Spitzen-Röhrchen-Verbindungsstück, doppeltem RN-Glas-Kupplungselement und der Glas-Mikropipette mit Mineralöl gefüllt ist. Ersetzen Sie bei Verwendung des hydraulischen Injektionssystems die Nadel durch eine Hamilton 9 0 0 3 0 Nadel.

Bringen Sie anschließend eine Gummiseptum über die Hamilton 9 0 0 3 0 Nadel an, um beim Einspritzen des Mineralöls eine Abdichtung zu gewährleisten. Stecken Sie die Hamilton 9 0 0 3 0 Nadel der Spülspritze in das hintere Ende des Zylinders der 10-Mikroliter-Hamilton-Spritze des Injektionssystems. Drücken Sie das Septum fest gegen das Ende der Spritze, um eine dichte Verbindung zu erzeugen.

Drücken Sie den Kolben langsam herunter, sodass das Mineralöl durch die Glasbestandteile des Injektionssystems fließt und die Glaspipette füllt. Schieben Sie das gesamte Öl durch das Injektionssystem, um eventuelle Luftblasen entlang der Bahn zu entfernen.

Wenn die Füllspritze an Mineralöl zur Neige geht, die Nadel langsam zurückziehen, während kontinuierlich Öl abgegeben wird. Um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, die Spülspritze erneut mit Öl befüllen und erneut injizieren. Wenn das gesamte System mit Mineralöl gefüllt ist, den ursprünglichen Kolben der 10-Mikroliter-Spritze einsetzen.

Hamilton-Spritze: Den Kolben vollständig herunterdrücken, um zusätzliches Mineralsöl aus dem System zu entfernen. Die Glas-Mikropipette und das Ende der Spritze sauber wischen. Mit 70 % Ethanol den Kolben bis zur Markierung von zwei Mikrolitern am Zylinder zurückziehen.

Das Ende der Glas-Mikropipette füllt sich mit Luft und bildet so eine Pufferzone zwischen dem Mineralöl und der zu injizierenden Flüssigkeit. Füllen Sie den Pipettenkörper, indem Sie das Ende der Mikropipette in die gewünschte Lösung tauchen und den Kolben der Hamilton-Spritze zurückziehen. Für eine intraokulare Injektion werden nicht mehr als vier bis fünf Mikroliter der Lösung in das Auge einer erwachsenen Ratte injiziert.

Schalten Sie zunächst den Gasfluss auf die Gasmaskenhalterung für den stereotaktischen Rahmen um. Anschließend platzieren Sie eine mit Isofluran anästhesierte Ratte in der stereotaktischen Vorrichtung. Reduzieren Sie die Isoflurankonzentration auf 2 % und überwachen Sie die Anästhesie.

Bedecken Sie das Tier mit einer chirurgischen Decke. Um die Körpertemperatur während der Operation aufrechtzuerhalten, öffnen Sie die Augenlider und geben Sie einen Tropfen anästhetische Lösung auf die Augenoberfläche. Für die Injektion auf der Hornhautoberfläche werden zwei Personen benötigt: Eine Person führt die Glaspipette in die Glaskörperhöhle ein und hält die Pipette in Position.

Und eine weitere, um den Kolben der Spritze niederzudrücken, wodurch die gewünschte Lösung abgegeben wird. Unter einem Operationsmikroskop halten Sie die Glas-Mikropipette und den doppelten RN-Glas-Kuppler fest, spreizen Sie die Augenlider zu einer V-Form entgegengesetzt der Injektionsstelle. Mit den Fingern hebt sich das Auge aus der Augenhöhle heraus. Führen Sie die Spitze der Glas-Mikropipette vorsichtig in einem gefäßfreien Bereich durch die Sklera in abwärts gerichtetem Winkel ein.

Wenn die Pipette in die Sklera eindringt, ist ein kleiner Druckabfall spürbar. Die Person, die die Spritze hält, sollte nun vier Mikroliter Lösung injizieren, indem sie den Kolben bis zur Zwei-Mikroliter-Markierung auf der Spritze niederdrückt. Die Injektion sollte ungefähr ein bis zwei Sekunden dauern.

Die erfolgreich injizierte Lösung spült durch die Glaskörperkammer, halten Sie die Mikropipette etwa fünf Sekunden lang stabil und ziehen Sie sie dann in dieselbe Richtung zurück, in der die Nadel eingeführt wurde. Die Bindehaut legt sich anschließend wieder über die kleine Öffnung und trägt so zur Versiegelung der skleralen Punktion bei. Sobald der Eingriff abgeschlossen ist, schalten Sie das Isofluran aus und lassen Sie das Tier mehrere Minuten lang Sauerstoff atmen. Bedecken Sie die Oberfläche der Hornhaut mit einem Augensalbe für die Augenheilkunde, um eine Austrocknung der Hornhaut während der Erholungsphase zu verhindern, nehmen Sie das Tier danach aus dem stereotaktischen Gerät und bringen Sie es in den Erholungskäfig zurück.

Um retinale Ganglienzellen durch retrograden Transport nach einer Exotomie zu beeinflussen. Führen Sie zunächst einen Sehnervdurchtrennungsversuch gemäß den Anweisungen im begleitenden Video „Protokoll zur Sehnervdurchtrennung“ durch, 2, 2 4, 1 Tracer, Medikamente. Plasmide, siRNAs oder virale Vektoren können auf den Sehnervstumpf aufgebracht werden.

Es gibt zwei Hauptmethoden, um dieses Verfahren durchzuführen: mithilfe von Gelatineschwamm oder durch direkte Injektion in den Sehnerv. Falls die Gelatineschwamm-Methode verwendet wird, muss sichergestellt werden, dass die retinalen Ganglienzellen zuvor durch Injektion von retrograden Tracern in den Colliculus superior eine Woche vor der Taxonomie markiert wurden. Unmittelbar nachdem der Sehnerv durchtrennt wurde, wird ein kleines Stück Gelatineschwamm, das mit der experimentellen Lösung getränkt ist, auf den durchtrennten Sehnervstumpf gelegt; anschließend werden die Orbitainhalte an ihre ursprüngliche Position zurückverlagert.

Wenn das Auge in eine neutrale Position zurückgebracht wurde, verwenden Sie eine Pinzette, um das Gelatineschwämmchen in die Augenhöhle zu schieben, wobei sichergestellt werden muss, dass es über dem Ende des Sehnervs verbleibt. Die Injektionstechnik ist effektiver für die Applikation von Substanzen, die Zugang zum Zytoplasma des Axons erhalten müssen, um durch axoplasmatischen Fluss retrograd transportiert zu werden. Eine gasdichte Hamilton-Spritze mit 10 Mikroliter wird verwendet, um die gewünschte Lösung in den durchtrennten Sehnerv zu injizieren. Eine Nadel mit kurzem Abschrägungswinkel ist von Vorteil.

Befüllen Sie die Spritze mit 10 Mikrolitern der zu injizierenden Lösung. Typischerweise irna-Plasmide oder virale Vektoren, um die Kante des Sehnervs mit feinen Dumont-Forceps zu fassen. Führen Sie die Nadelspitze parallel zum Nerv in den Sehnerv ein.

Bis die Abschrägung nicht mehr sichtbar ist, wird die eingeführte Nadel von allen Seiten vom Nerv umschlossen. Sobald die Nadel eingeführt ist, vorsichtig die Seiten des Nervs mit der feinen Pinzette zusammendrücken und ein Viertel der Lösung injizieren, während man die Spritze dreht. Eine Vierteldrehung im oder gegen den Uhrzeigersinn.

Wiederholen Sie diese Schritte, bis eine vollständige Umdrehung der Nadel erfolgt ist und der gesamte Inhalt der Spritze injiziert wurde. Entfernen Sie die Spitze der Spritze vom Nerv. Belassen Sie jegliche injizierte Flüssigkeit, die aus dem Nerv zurückfließt, im Orbit, da sich dadurch ein zusätzlicher Vorrat für die Aufnahme durch die Enden der Axone bildet.

Bringen Sie den Inhalt der Orbita in die ursprüngliche Position zurück, schließen Sie die Wunde und lassen Sie das Tier sich erholen. Die Tiere sollten nach der Operation einzeln untergebracht werden. Postoperative Analgetika sollten gemäß den Richtlinien Ihrer Tierversuchseinrichtung verabreicht werden.

Behörden und Tiere sollten nach der Operation sorgfältig überwacht werden. Wie in diesem Video gezeigt, können RGCs direkt angegriffen werden, indem Peptide, Wirkstoffe, Vektoren, Plasmide oder siRNAs auf den durchtrennten Sehnervenstumpf appliziert werden. In diesem repräsentativen Beispiel wurde eine retrograde Markierung mit Fluoro-Gold durchgeführt und anschließend sofort drei markierte Peptide in den Sehnerv injiziert.

Anschließend erfolgte die Live-Bildgebung der Netzhaut, um zu verhindern, dass die Peptide während der Fixierung aus dem Gewebe auswaschen, wie hier zu sehen ist: Drei mit SI markierte Peptide, die in den Sehnerv injiziert wurden, wurden retrograd zurück zu den RGC-Somata in der Netzhaut transportiert. In diesem Beispiel wurden drei mit SI markierte siRNAs in den Sehnervstumpf injiziert. Unmittelbar nach der Sehnervdurchtrennung wurde erneut eine Live-Bildgebung der Netzhaut durchgeführt, und es zeigte sich, dass die in den Sehnerv injizierten, mit SI markierten siRNAs retrograd von den RGCs transportiert wurden, wie durch ihre Kolokalisation angezeigt.

Mit der Fluorgold-Retrogrademarkierung kann diese Technik, einmal beherrscht, bei korrekter Durchführung in Sekunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist darauf zu achten, die Linse nicht zu beschädigen. Vergessen Sie nicht, dass der Umgang mit viralen Partikeln äußerst gefährlich sein kann, und die institutionellen Richtlinien für den Umgang mit biohazardstoffen sollten stets befolgt werden, während dieses Verfahren durchgeführt wird.