Die Quantifizierung der Synapsen: eine Immunzytochemie-basierten Assay zur Synapse Anzahl Quantify

Eines der wichtigsten Ziele der Neurowissenschaften ist es, die molekularen Signale zu verstehen, die die frühen Phasen der Synapsenbildung steuern. Daher ist es unerlässlich geworden, objektive Methoden zu entwickeln, um Veränderungen in der synaptischen Vernetzung zu quantifizieren. Um die Anzahl der Synapsen in verschiedenen experimentellen Präparationen zu bestimmen, werden kultivierte Neuronen oder gefrorene Schnittpräparate von Gehirngewebe mit selektiven prä- und postsynaptischen Markern gefärbt, um Kontaktstellen zwischen Neuronen sichtbar zu machen.

Die Zellen oder Gewebe werden anschließend an einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet, wobei acht-Bit-Bilder für jeden der Kanäle erforderlich sind, die den beiden immunhistochemischen Markern entsprechen. Die Analyse der Bilder erfolgt mit ImageJ 1.29 unter Verwendung des Puncta-Analysators. Um das Ausmaß der Kolokalisation zwischen prä- und postsynaptischen Markern zu bestimmen, können die Kolokalisationstellen genutzt werden, um die Anzahl der in der Probe vorhandenen Synapsen zu ermitteln.

Der Hauptvorteil dieser hier beschriebenen Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Elektronenmikroskopie liegt darin, dass der Synapsen-Assay eine deutlich umfangreichere Analyse und Quantifizierung der Anzahl von Synapsen ermöglicht. Die wesentlichen Implikationen dieser Technik betreffen die Diagnose und Therapie klinischer Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit, Epilepsie oder Autismus, bei denen Abnormalitäten und gestörte synaptische Vernetzung als Grundlage der zugrundeliegenden Pathologie vermutet werden. Mithilfe dieser Technik lassen sich gezielte therapeutische Maßnahmen identifizieren, die die Defizite in der Fähigkeit betroffener Neuronen, Synapsen miteinander auszubilden, verringern oder beseitigen können.

Obwohl diese Methode nützlich für die Untersuchung der Gehirnentwicklung ist, kann sie auch auf andere Modellorganismen oder Organsysteme angewendet werden, bei denen Sie die Anzahl der Zell-Zell-Kontakte untersuchen oder quantifizieren möchten, für die Sie die Möglichkeit haben, jede gegenüberliegende Seite jeder Kontaktstelle gezielt zu markieren. Bereiten Sie neuronale Kulturen vor, indem Sie gereinigte retinale Ganglienzellen von Ratten aus der Rattenretina, gewonnen von P5 bis P7-Tieren, auf mit Poly-D-Lysin beschichteten Deckgläsern ausplattieren. In einer 24-Loch-Platte werden die Zellen drei bis fünf Tage bei 37 °C vor der Transfektion wachsen gelassen.

Nach der Transfektion die Zellen weitere sieben bis acht Tage inkubieren, damit sich Synapsen bilden können, sobald die ausgesäten Zellen ausreichend ausgereift sind. Das Kulturmedium aus den Vertiefungen entfernen und 500 Mikroliter vorgewärmtes, 4 %iges Paraformaldehyd zur Fixierung je Vertiefung sieben Minuten lang hinzufügen. Nach der Fixierung bei Raumtemperatur die Zellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung spülen.

Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Zellen in den Vertiefungen niemals austrocknen. Sobald ein Puffer von einer Vertiefung entfernt wurde, sollte er umgehend durch den nächsten Puffer ersetzt werden. Bereiten Sie einen Blockierpuffer, der 50 % normales Ziegenserum und 0,2 % Triton X-100 enthält.

Nachdem das PBS von jedem Brunnen entfernt wurde, jeweils 200 Mikroliter Puffer zur Blockierung hinzufügen und 30 Minuten lang blockieren. Bei Raumtemperatur den Blockierungspuffer entfernen und dreimal mit PBS spülen. Eine Verdünnung des Primärantikörpers in 90 % Antikörperpuffer, 10 % NGS-Lösung herstellen, die das gewünschte prä- und postsynaptische Antikörperpaar enthält.

Hier werden ein Kaninchen-Antikörper gegen Synapsin, ein präsynaptischer Marker, und ein Maus-Antikörper gegen Homer, ein postsynaptischer Marker, verwendet. Zentrifugieren Sie die Primärantikörperlösung fünf Minuten lang mit maximaler Geschwindigkeit in einer Tischzentrifuge, um ausfällenden Antikörper zu entfernen, und geben Sie anschließend 200 Mikroliter der Primärantikörperlösung in jedes Brunnen. Stellen Sie die Platte in einen befeuchteten Behälter, um das Austrocknen der Primärantikörperlösung zu verhindern.

Inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius, nachdem Sie mit dem primären Antikörper inkubiert haben. Spülen Sie jede Vertiefung dreimal. Geben Sie mit PBS 200 Mikroliter der geeigneten sekundären Antikörper hinzu, verdünnt im Verhältnis 1 zu 1000 in Antikörperpuffer, der 10 % NGS enthält, hergestellt.

Wie zuvor die Schale in die befeuchtete Kammer geben und nach der Inkubation mit den Sekundärantikörpern zwei Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Jedes Loch dreimal bis viermal mit PBS spülen. Einen Tropfen Eindeckmedium (Vector Shield) mit DPI auf einen Objektträger geben.

Danach invertieren Sie das Deckglas mit den Zellen und legen es auf den Tropfen, um es zu montieren. Abschließend tragen Sie klaren Nagellack an den Rändern des Deckglases auf. Achten Sie darauf, das Deckglas während des Auftragens nicht zu verschieben oder zu bewegen.

Da dies die Zellen teilt, lassen Sie die Objektträger mindestens 30 Minuten an einem trockenen, dunklen Ort trocknen. Die Bildgebung erfolgt hier mit einem ZEISS Axio Imager-Fluoreszenzmikroskop, das mit geeigneten Filterblöcken und einem 63-fachen Öl-Immersion-Objektiv ausgestattet ist. Legen Sie einen Objektträger mit nicht transfizierten Zellen auf den Mikroskopständer.

Wählen Sie unter Verwendung des DPI-Filtersets zur Visualisierung der Zellkerne Zellen aus, die mindestens zwei Zelldurchmesser von ihren nächsten Nachbarn entfernt liegen. Die Verwendung von DPI in diesem Schritt hilft, Verzerrungen zu vermeiden und gewährleistet eine zufällige Zellauswahl. Erstellen Sie für jede ausgewählte Zelle 8-Bit-Bilder unter Verwendung der geeigneten Filtersets, in diesem Fall GFP und Texas Red.

Das überlagerte, pseudofarbig dargestellte Bild sollte prä- und postsynaptische Marker in Rot bzw. Grün zeigen. Als Nächstes wird ein Objektträger mit transfizierten Zellen auf den Mikroskopständer gelegt. Hier wurden die Zellen mit einem TD-Tomato-Expressionsvektor transfiziert.

Verwenden Sie diesen Marker, um Zellen wie zuvor auszuwählen. Erhalten Sie für jede ausgewählte Zelle acht Punktionsbilder unter Verwendung der geeigneten Filter-Sets, in diesem Fall GFP, Texas Red und Sci fünf. Das überlagerte pseudofarbige Bild sollte die post-synaptischen Marker in Rot, Grün und Blau aufweisen.

Hier wird das Punktions-Analyse-Programm zur Quantifizierung ko-lokalisierter synaptischer Punktionen verwendet. Das Puncta-Analyzer-Plugin wurde von Barry Walk verfasst und ist auf Anfrage in Image J 1.26 verfügbar. Öffnen Sie eines der gesammelten Bilder.

Verwenden Sie das kreisförmige Auswahlwerkzeug, um einen Bereich auszuwählen, der radial etwa einem Zelldurchmesser um die Region von Interesse (SOR) entspricht. Wenn die Region von Interesse ausgewählt ist, gehen Sie zum Menü „Plugins“ und wählen Sie im erscheinenden Analyseoptionen-Fenster „Puncture Analyzer“ und anschließend „Roter Kanal, Grüner Kanal“. Führen Sie zunächst die Hintergrundsubtraktion durch und legen Sie die Ergebnisdatei fest.

Klicken Sie auf „Okay“. Legen Sie anschließend einen Speicherort für die Ergebnisse fest. Die Ergebnisse können im erscheinenden Fenster nach Excel exportiert werden, um sie dort weiter zu analysieren.

Als Nächstes stellen Sie sicher, dass ein Rollkugelradius von 50 ausgewählt ist, und deaktivieren Sie die Option für den weißen Hintergrund. Diese Änderung ist nicht erforderlich, wird jedoch häufig von Anwendungsbenutzern bevorzugt. Klicken Sie zur einfacheren Visualisierung auf „Okay“.

Es erscheint ein neues Fenster zusammen mit einer Maske, die dem Bild des roten Kanals entspricht. Passen Sie die Schwelle so an, dass die rote Maske möglichst gut mit den einzelnen diskreten Punktstrukturen übereinstimmt, ohne jedoch zu viel Rauschen einzuführen. Klicken Sie anschließend auf „Fertig“.

Stellen Sie die minimale Punktgröße auf vier Pixel ein. Ändern Sie nichts anderes. Klicken Sie auf OK.

Wiederholen Sie den vorherigen Schritt nun für den grünen Kanal. Nachdem Sie dies mit dem grünen Kanal wiederholt haben, liefert das Plugin eine Quantifizierung, die jeweils den Pünktchen in jedem Kanal einzeln sowie den ko-lokalisierten Pünktchen zwischen den beiden Kanälen entspricht. Der hier gezeigte Synapsentest kann auf Kryoschnitte aus dem Gehirn sowie auf jedes andere Nervensystemgewebe wie Rückenmark oder Netzhaut angewendet werden.

Sofern ein geeignetes Prä- und Postsynapse-Markerpaar vorliegt, beginnen Sie mit der Gewinnung von Hirngewebe von einer Maus, die durch Exsanguination und Perfusion mit PBS euthanasiert wurde. Am nächsten Tag das gesamte Gehirn über Nacht bei vier Grad Celsius in 4 % Paraldehyd in PBS einlegen.

Spülen Sie das Gehirn dreimal mit PBS. Schützen Sie das Gehirn kryoprotektiv, indem Sie es in 30 % Sucrose in PBS geben.

Das Gewebe schwimmt anfangs; es ist bei vier Grad Celsius zu belassen, bis das Gewebe auf den Boden gesunken ist. Zu diesem Zeitpunkt ist der Kryoschutz abgeschlossen. Als Nächstes das Gehirn in einer zwei-zu-eins-Lösung aus 20 % Saccharose zu OCT und PBS in der gewünschten Orientierung für die Schnittführung einbetten.

Zum Beispiel sagittal oder koronal. Als Nächstes legen Sie eine flache Metallfläche auf einen Eimer mit Trockeneis. Legen Sie das eingebettete Gehirn darauf, um es einzufrieren; sobald es eingefroren ist, überführen Sie das Gehirn in einen Gefrierbeutel und lagern Sie es bis zu einem Jahr bei minus 80 Grad Celsius, bevor es geschnitten wird.

Schneiden Sie das Gewebe mit einem Kryostaten in 12 bis 16 Mikrometer dicke Schnitte und bringen Sie diese auf Objektträgern auf. Trocknen Sie die Objektträger anschließend, indem Sie sie in einen 37 °C warmen Ofen stellen. Spülen Sie sie danach dreimal mit PBS, um restliches OCT zu entfernen.

Ein Paraffin-Stift wird verwendet, um eine hydrophobe Barriere um den Objektträger herum zu erzeugen, und Puffer zum Blockieren wird auf den Objektträger gegeben, wobei das Paraffin den Abfluss verhindert. Legen Sie die Objektträger zur Blockierung eine Stunde bei Raumtemperatur in 20 % normales Ziegenserum in PBS. Anschließend geben Sie die Schnitte in primäre Antikörper, die in PBS mit 0,3 % Triton und 10 % normalem Ziegenserum verdünnt sind.

Hier wird Kaninchen-Antikörper gegen PSD-95 verwendet, um glutamaterge postsynaptische Kompartimente zu markieren, und Meerschweinchen-Antikörper gegen vGluT2, um glutamerge präsynaptische Endigungen zu markieren. Die Objektträger bei vier Grad Celsius platzieren und 36 bis 60 Stunden inkubieren. Nach der Inkubation den Primärantikörper durch dreimaliges Eintauchen der Objektträger in PBS je 15 Minuten abwaschen.

Nach diesem Schritt sicherstellen, dass die Objektträger vor direktem Licht geschützt werden. Sekundäre Antikörper im Verhältnis 1 zu 200 in PBS mit 0,3 % Triton und 10 % normalem Zieuserserum applizieren. Hier: Ziege anti Meerschweinchen.

Alexa 488 und Ziegen-Anti-Kaninchen. Alexa 594 werden verwendet. Inkubieren Sie zwei Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln.

Spülen Sie die Objektträger durch viermaliges Eintauchen in PBS je 15 Minuten, um sie einzubetten. Geben Sie kleine Tropfen des Vector Shield-Einbettmediums mit DAPI zu und decken Sie die Objektträger mit Deckgläsern ab. Tragen Sie Nagellack auf, um Bewegungen der Deckgläser zu verhindern.

Die Bildgebung von Gewebeschnitten sollte mithilfe eines konfokalen Mikroskops mit geeigneten Lasern unter Verwendung eines 63-fachen Öl-Immersion-Objektivs für jedes Schnittbild durchgeführt werden, wobei serielle optische Schnitte in 0,33-Mikrometer-Abständen über eine Gesamttiefe von fünf Mikrometern angefertigt werden, was insgesamt 15 optische Schnitte ergibt. Von jedem Tier müssen mindestens drei Schnitte abgebildet werden, und mindestens drei Tiere müssen aus einer gegebenen experimentellen Bedingung stammen. Erstellen Sie Projektionen der maximalen Intensität aus Gruppen von jeweils drei aufeinanderfolgenden optischen Schnitten, wodurch fünf Projektionen entstehen, die jeweils eine Tiefe von einem Mikrometer repräsentieren.

Sie werden mit Image J quantifiziert, wie zuvor für dissoziierte RGCs mit einem modifizierten ROI beschrieben, um die Anzahl der Synapsen zu bestimmen, die in Abwesenheit von Astrozyten gebildet wurden. Die Immunchemie wurde an dissoziierten RGCs durchgeführt, die mit basalem Wachstumsmedium behandelt wurden, unter Verwendung von Antikörpern gegen Bassoon (rot dargestellt) und Homer (grün dargestellt), wie erwartet. Es wurden nur sehr wenige Punkte synaptischer Kolokalisation beobachtet, um den Einfluss von von Astrozyten sezernierten Molekülen auf die Anzahl der in vitro gebildeten Synapsen zu bestimmen. Dazu wurden dissoziierte RGCs alle drei Tage mit konditioniertem Medium von Maus-Astrozyten über einen Zeitraum von insgesamt 12 Tagen behandelt, gefolgt von der Färbung.

Zahlreiche Synapsen waren in diesem Neuron erkennbar, doch bald wird in Rot dargestellt. Homer wird in Grün in dissoziierten RDCs, die mit zytoplasmatischem Lee exprimiertem TD-Tomato transfiziert wurden, dargestellt und erhielten nur basales Wachstum. Synapsen im Medium sind nicht sichtbar.

TD-Tomate erscheint in Blau und Synapsen erscheinen in Rot. Für den postsynaptischen Marker Homer, dargestellt in Grün, ist ein sehr schwaches Signal sichtbar. Wenn dieselben Zellen chronisch mit konditioniertem Medium von Rattenastrozyten behandelt werden, sind zahlreiche Synapsen sichtbar.

TD-Tomate ist hier blau, Synapsin rot und Homer grün dargestellt. Gezeigt ist eine gereinigte RGC, die mit astrozytenkonditioniertem Medium behandelt wurde und für präsynaptische Marker in Rot sowie postsynaptische Homer-Marker in Grün angefärbt ist. Die mithilfe des Puncta-Analysers erzeugten Schwellwertmasken entsprechen den beiden vorhandenen Kanälen. Nach Identifizierung der Kolokalisationstellen liefert der Puncta-Analysator eine grafische Darstellung dieser Punkte.

Der Puncta-Analysator liefert ein numerisches Ergebnis, das die Anzahl der diskreten Puncta angibt, die in beiden Kanälen sowie an Kolokalisationstellen identifiziert wurden. Die durch die Analyse dieses Neurons gewonnenen Daten veranschaulichen die Fähigkeit von Astrozyten sezernierten Molekülen, die Bildung von Synapsen zu fördern, hier dargestellt als Synapsen-Assay, bei dem die Kolokalisation von prä- und postsynaptischer immunhistochemischer Markierung quantifiziert wurde, um die Potenzierung der durch Astrozyten induzierten Synapsenbildung durch Überexpression des neuronalen Rezeptors für das wichtige, von Astrozyten sezernierte synaptogenische Molekül Thrombospondin nachzuweisen. In dieser Abbildung ist die durchschnittliche Anzahl von Synapsen pro Neuron dargestellt, der chronisch mit basalem Wachstumsmedium (gm) oder mit astrozytenkonditioniertem Medium behandelt wurde.

A-C-M-A-C-M fördert die Synapsenbildung in retinalen Ganglienzellen, die den Thrombospondinrezeptor überexprimieren, stärker als Zellen, die einen leeren Vektor überexprimieren. Um die synaptische Dichte im vorderen Hügel des Mäuses zu quantifizieren, wurden prä- und postsynaptische Kompartimente getrennt mithilfe kompartiment-spezifischer immunhistochemischer Marker gefärbt. Wie hier gezeigt, nahm die Anzahl der Synapsen vom postnatalen Tag sieben bis zum 14. Tag (P14) zu.

Dies veranschaulicht die Zunahme der Synapsenzahl im superior ulcus während dieses Entwicklungszeitfensters. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie in etwa zwei Tagen für dissoziierte neuronale Kulturen und in etwa fünf Tagen für Gehirnschnitte – beginnend mit der Gewinnung aus dem Tier gemäß diesem Verfahren – abgeschlossen werden. Andere Methoden wie die Elektrophysiologie und die Elektronenmikroskopie werden verwendet, um zu überprüfen, ob die Veränderungen in der Synapsenzahl jeweils Veränderungen in funktionellen Synapsen und ultrastrukturell normalen Synapsen widerspiegeln.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Immunhistochemie an Ihrer experimentellen Präparation anwendet, um die Anzahl der Synapsen zu quantifizieren. Dieses Protokoll beschreibt detailliert, wie kompartimentenspezifische Antikörper verwendet werden, um prä- und postsynaptische Kompartimente gezielt zu markieren. In diesem Zusammenhang definieren wir Synapsen als Stellen der Kolokalisation zwischen den Signalen, die von jedem dieser Marker erhalten werden.