Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning der Proboscis Erweiterung Reaktionszeit in Honigbienen ( Apis mellifera)

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die dem Lernen und der Gedächtnisbildung zugrunde liegen. Bei Honigbienen ist der erste Schritt, frei fliegende Bienen aus ihrem Stock zu sammeln. Anschließend werden die Bienen in Plastikröhrchen fixiert.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht in der Durchführung einer klassischen Konditionierung. Um deren Einfluss auf Lernen und Gedächtnisbildung zu untersuchen, können Medikamente zu bestimmten Zeitpunkten um die Konditionierung herum injiziert werden. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Überprüfung der Gedächtnisretention.

Schließlich können Veränderungen des Verhaltens nach einer Behandlung mit einem Wirkstoff die molekularen Mechanismen offenbaren, die Lernen und Gedächtnisbildung zugrunde liegen. Bei Honigbienen kann diese Methode dabei helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet des Lernens und Gedächtnisses zu beantworten, indem sie die molekularen Mechanismen der Gedächtnisbildung aufdeckt.

Allgemein haben Forscher, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da der Zeitpunkt der Reizpräsentation während der Konditionierung und des Abrufs des Gedächtnisses exakt sein muss. Auch das Fütterungsregime ist entscheidend. Das Verfahren wird demonstriert, indem Gearing und Johannes Faberg Studierenden aus meinem Labor zeigen, wie es funktioniert. Am Tag vor dem Experiment sammeln Sie Bienen zwischen 14:00 und 16:00 Uhr mithilfe einer UV-Licht-durchlässigen Plexiglaspyramide.

Bringen Sie die Pyramide im Labor zurück auf ihre Basis und verdunkeln Sie die Wände mit einem Tuch, wobei die Spitze frei bleibt. Öffnen Sie die Spitze und halten Sie ein Glasfläschchen über die Öffnung, sodass eine einzelne Biene in das Fläschchen gelangen kann, bevor Sie es wieder verschließen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Bienen im Herbst und Winter in ein Glasfläschchen überführt wurden.

Wenn die Bienen nicht im Freien fliegen, wird ein Bienenstock innerhalb eines Gewächshauses in einem Netz aufbewahrt, und einzelne Bienen werden direkt aus dem Netz gefangen. Um eine Biene zu immobilisieren, wird ein Glasröhrchen pro Biene verwendet, das für zweieinhalb bis dreieinhalb Minuten auf Eis gekühlt wird. Die Biene ist sorgfältig zu überwachen und vom Eis zu nehmen, sobald sie sich nicht mehr bewegt.

Fixieren Sie die Biene in einem kleinen Plastikröhrchen mit Klebeband. Achten Sie darauf, dass die Biene ihre Oszis frei bewegen kann, jedoch nicht ihren Kopf, Thorax oder die Beine. Es ist außerdem wichtig, den Halsbereich nicht zu komprimieren.

Wenn eine Biene vorbereitet ist, stellen Sie das Röhrchen in eine nummerierte Bohrung in einem Gestell, um die Handhabung und Identifizierung zu erleichtern.

Die Röhrchen werden stets in dieselbe Bohrung zurückgebracht. Nach der Handhabung füttern Sie die Bienen zwischen 16:00 und 18:00 Uhr an einem vom Konditionierungsort verschiedenen Ort. Lösen Sie die Proboscis-Verlängerungsreaktion (PER) aus, indem Sie die Bienen und ihre Antennen berühren.

Mit einer Saccharoselösung lässt man die Biene einen Tropfen von etwa vier Mikrolitern SRA-Lösung aufnehmen. Dabei darauf achten, dass keine Verschmierung der Antennen, des Prothorax oder des Plastikröhrchens erfolgt. Jede Biene so lange füttern, bis sie nicht mehr frisst.

Zeigen Sie eine schnelle und zuverlässige PER, wenn ihre Antennen mit der Lösung berührt werden. Füttern Sie jede Biene an den folgenden Abenden des Experiments viermal mit einem Tropfen Saccharoselösung. Füllen Sie eine Plastikschale etwa 0,5 bis einen Zentimeter hoch mit Leitungswasser.

Stellen Sie das Gestell mit den angegurteten Bienen mithilfe einer Lysa-Platte als Plattform in die Schüssel. Bedecken Sie die Schüssel mit Pappe und lagern Sie sie bei Raumtemperatur über Nacht. Die Bienen durchlaufen am Morgen nach der Sammlung gegen 10:00 Uhr eine olfaktorische Konditionierung.

30 Minuten vor Versuchsbeginn. Stellen Sie das Gestell mit den geharnischten Bienen in die Nähe des Konditionierungsorts, jedoch weg von der Öffnung des Abluftrohrs, wo die Bienen trainiert werden. Bereiten Sie danach den konditionierten Reiz vor, wobei Sie in einer Abzugshaube arbeiten.

Verwenden Sie eine Filterpipettenspitze, um vier Mikroliter Nelkenöl auf ein rundes Filterpapier zu pipettieren. Legen Sie das parfümierte Filterpapier in eine 20-Milliliter-Spritze und setzen Sie den Kolben ein. Stellen Sie den Audioplayer so ein, dass er ein akustisches Signal an den Experimentator abgibt.

Dies gewährleistet die genaue Abstimmung von Reizzeitpunkt, Reizbeginn, Reizende, Dauer und Platzierung. Bereiten Sie sich darauf vor, das Verhalten der Biene während der Konditionierung aufzuzeichnen. Eine positive Bewertung erfolgt, wenn die Biene ihren SSIS zwischen dem Beginn des konditionierten Reizes und der Darbietung des unkonditionierten Reizes ausführt.

Überqueren einer virtuellen Linie zwischen den geöffneten Mandibeln Um einen Erwerbsversuch zu beginnen, wählen Sie die zu trainierende Biene aus und positionieren Sie sie 10 Sekunden lang vor dem Abluftstutzen. Kurz vor dem Ende dieses zehnsekündigen Intervalls platzieren Sie die mit Duftstoff gefüllte Spritze drei Zentimeter von der Biene und ihren Antennen entfernt. Präsentieren Sie den Duftstoff über fünf Sekunden, indem Sie 20 Milliliter Luft durch die Spritze drücken.

Nach drei Sekunden wird der unkonditionierte Reiz eingeführt, indem der ventrale Teil der distalen Flagellen beider Antennen mit einer Zuckerlösung auf einem angefeuchteten Wattestäbchen berührt wird. Dabei ist darauf zu achten, dass keine Lösung auf die Biene oder ihre Antennen gelangt; anschließend darf die Biene das Wattestäbchen ablecken. Dieser zusammengesetzte Reiz dauert vier Sekunden an, danach werden die Bienen aus dem Trainingskontext entfernt und zurück in das Gestell gebracht.

13 Sekunden nach der Präsentation des konditionierten Reizes dauert ein Trainingsdurchgang 28 Sekunden. Bringen Sie die Biene nach einem Intervall von 10 Minuten zwischen den Durchgängen zum Trainingsort zurück. Führen Sie den zweiten von drei Durchgängen wie zuvor gezeigt durch und warten Sie weitere 10 Minuten, bevor Sie die letzte Koppelung durchführen.

Nach Abschluss des täglichen Trainings stellen Sie die Racks wieder in die Schale zurück. Denken Sie daran, jede Biene zwischen 16:00 und 18:00 Uhr viermal mit je einem vier Mikroliter großen Tropfen Saccharoselösung zu füttern. Wie bereits gezeigt, können Retentionstests in einem beliebigen Intervall – von Minuten bis Tagen – nach dem Training durchgeführt werden. Bereiten Sie den Gedächtnistest vor, indem Sie den Bienenrack 30 Minuten lang in die Nähe des Konditionierungsortes stellen.

Beginnen Sie den Test, indem Sie eine Biene 10 Sekunden lang vor die Abluft stellen. Bieten Sie den konditionierten Reiz fünf Sekunden lang dar und notieren Sie das Auftreten einer PER. Nach Abschluss der Tests für den Tag stellen Sie die Gestelle wieder in die Schale zurück.

Denken Sie daran, jede Biene viermal zwischen 16:00 und 18:00 Uhr mit je einem vier Mikroliter großen Tropfen Saccharoselösung zu füttern, wie zuvor am Ende des gesamten Experiments gezeigt. Überprüfen Sie, ob die Biene noch in der Lage ist, ihren Rüssel auszustrecken, indem Sie die Antenne mit SRA-Lösung berühren, um sie in die Analyse einzuschließen. Die Bienen müssen das gesamte Experiment überleben und eine intakte PER aufweisen. In einigen Studien werden systemische Injektionen verwendet, um den Einfluss pharmakologischer Interventionen auf das olfaktorische Gedächtnis zu untersuchen. Diese Injektionen können zu unterschiedlichen Zeitpunkten je nach Versuchsdesign verabreicht werden.

Beginnen Sie damit, mit einer Einweg-Hypodermikanadel ein kleines Loch in das Cuticula des hinteren Teils des S-scootin in der Nähe der S-scootle-Fissur oberhalb des Flugmuskels zu bohren. Füllen Sie anschließend ein Glas-Kapillarrohr mit einem Mikroliter der zu testenden Lösung. Führen Sie die Kapillare in das Loch im Cuticula ein und injizieren Sie die Lösung in den Flugmuskel.

Erfahrene Experimentatoren können alle 30 Sekunden eine B-Injektion durchführen, wodurch eine präzise zeitliche Steuerung von Injektion und Konditionierung möglich ist. Hier werden zwei Experimente vorgestellt. Im ersten Experiment wird der Einfluss einer systemischen Injektion von Kochsalzlösung, die vor dem Training verabreicht wird, auf das Lernen eines Gedächtnisses untersucht.

Es gibt drei Gruppen in dieser Studie: eine Gruppe, die keine Behandlung erhält, eine systemische Injektion von einem Mikroliter phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder eine Scheinbehandlungsgruppe. Diese Behandlungen wurden 30 Minuten vor dem Training verabreicht, das hier links dargestellt ist. Der Prozentsatz der Tiere, die während des Erwerbs die konditionierte Reaktion zeigten, stieg über die drei Trainingsdurchgänge an, wobei keine Unterschiede zwischen den Gruppen bestanden.

Die Balkendiagramme rechts zeigen, dass weder die PBS-Injektion noch die Scheinläsion die Gedächtnisretention beeinträchtigten. 24 Stunden nach dem Training im zweiten Experiment wurden Injektionen 40 Minuten nach dem Training verabreicht; anschließend wurden die Bienen in zwei Gruppen aufgeteilt: eine erhielt Kochsalzlösung, die andere ein Mikroliter des Proteinsyntheseinhibitors Anisomycin. Die Balkendiagramme rechts zeigen einen deutlichen Rückgang der Gedächtnisretention bei Bienen, die Anisomycin erhielten. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Proteinsynthese für die Bildung des olfaktorischen Gedächtnisses.

Mithilfe dieses Verfahrens können elektrophysiologische und elektrophysiologische Ableitungen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise nach der neurophysiologischen Grundlage von Lernen und Gedächtnisbildung nach ihrer Entwicklung. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Lern- und Gedächtnisforschung den Weg, um die molekularen und neurophysiologischen Mechanismen bei der Gedächtnisbildung in der Honigbiene zu erforschen.