Agar-Block Mikrokosmen für Controlled Pflanzengewebekultur Zersetzung durch aerobe Pilze

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen aeroben holzabbauenden Pilz in einem Petrischalen-Mikrokosmos zu inkubieren, bei dem die Holzfeuchte und exogene Substrate streng kontrolliert sind. Dies wird erreicht, indem zunächst Mikrokosmen mit exakten Volumina bekannter Medien vorbereitet werden. Anschließend werden das zu zersetzende Holz und gegebenenfalls exogene feste Substrate auf einem Kunststoffgitter an der Agaroberfläche angeordnet, wobei ein Kontakt zwischen den Substraten vermieden wird.

Der Mikrokosmos wird anschließend mit dem Testpilz beimpft und inkubiert. Nach der Inkubation werden die Holzproben entnommen, um den Massenverlust zu bestimmen und Gewebeproben für Analysen vorzubereiten. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die den Grad der biologischen Holzabbaus sowie die Rolle externer Elementquellen anhand von Massenverlustmessungen, Beobachtungen der Myzel-Morphologie und gezielter elementarer Analysen wie der induktiv gekoppelten Plasma-Spektroskopie aufzeigen.

Hallo, mein Name ist Brooke Jacobson aus dem Labor von Dr. Jonathan Schilling am Department für Bioprodukte und Biosystemtechnik der University of Minnesota. Heute werden wir Ihnen ein Verfahren zeigen, bei dem Petrischalen als Mikroumgebungen für die zelluläre Zersetzung von Pflanzengewebe durch aerobe Pilze verwendet werden. In unserem Labor nutzen wir dieses Verfahren, um die Mechanismen der lignocellulolytischen Zersetzung durch Pilze zu untersuchen.

Lignocellulose ist das Pflanzengewebe, das aus Lignin, Cellulose und Hemicellulose besteht. Das Gewebe, das wir am häufigsten untersuchen, ist Holz. Fehler im Zusammenhang mit den weniger technischen Aspekten der Gestaltung des Bohrblocksystems sind die häufigsten Ursachen für Versagen und die wichtigsten Variabilitätsquellen zwischen Studien, weshalb die Veröffentlichung eines Videos unserer Bohrblockanordnung nützlich ist. Aus Erfahrung wissen wir, dass dieses Verfahren hochwertige Ergebnisse mit geringer Variabilität liefert.

Beginnen wir also. Verwenden Sie für diese Experimente Petrischalen, die einen Zentimeter tiefer sind als herkömmliche Petrischalen, um den Freiraum über dem Holzblock im Mikrokosmos zu vergrößern.

Beginnen Sie die Mikrokosmos-Vorbereitung, indem Sie ausreichend Medium für 20 Milliliter pro Petrischale herstellen, das frei von Calcium und Eisen ist. Geben Sie Agar vom Typ a mit 15 Gramm Agar in einen 500-Milliliter-Messkolben, der etwa 400 Milliliter deionisiertes Wasser mit Zusätzen enthält. Verwenden Sie zuvor hergestellte Stammlösungen, um dem Gemisch Spurennährstoffe hinzuzufügen.

Nachdem die Nährstoffe hinzugefügt wurden, den Messkolben bis zur 500-Milliliter-Marke auffüllen. Anschließend das Medium in einen 1000-Milliliter-Kolben umfüllen. Sterilisieren im Autoklaven bei 121 Grad Celsius und 16 PSI für 20 Minuten.

Beachten Sie, dass das Volumen 500 Milliliter pro Kolben nicht überschreiten darf, um zu verhindern, dass das Agar vor der Verabreichung der Testplatten erstarrt. Nach dem Autoklavieren lassen Sie das Medium abkühlen, bis es sich kühl anfühlt, um Kondensationsbildung zu minimieren. Die Minimierung der Feuchtigkeit ist bei diesen Experimenten entscheidend, da Feuchtigkeitsgehalt oder mc.

Über 80 % verursachen Anoxie in Geweben. Begrenzen Sie den Zerfall durch aerobe Pilze und erhöhen Sie die Variabilität einmal. Kühlen Sie ab. Verwenden Sie eine manuelle Pipettierhilfe und 10-Milliliter-sterile Polystyrolpipetten, um aseptisch zu arbeiten.

Überführen Sie das Agar in einem Sicherheitswerkbank auf einen hohen Stapel von Platten. Schneiden Sie anschließend großzügig Plastiknetzgitter zurecht, sodass sie in die Plattenböden passen. Nach dem Zuschneiden und gründlichem Waschen der Gitter mit Seife und Wasser bereiten Sie die Netzgitter für das Trocknen und Autoklavieren zu Demonstrationszwecken vor.

Südgelber Kiefernholz oder SYP wird verwendet, da es eine wichtige Holzquelle darstellt. Verwenden Sie im Wohnhausbau in den USA unbehandeltes Holz und schneiden Sie knotenfreie Blöcke mit einer Größe von 19 mal 19 Millimeter aus einem einzigen Längsschnitt entlang der Maserung. Schneiden Sie diese Länge in 19-Millimeter-Würfel zurecht.

Teilen Sie die 19 mm³ großen Blöcke mithilfe eines Meißels und Hammers entlang der Maserung in zwei Hälften, anstatt eine Säge zu verwenden. Dadurch entsteht eine raue Kante, die im Agri-Block-Mikrokosmos nach unten auf dem Kunststoffgitter aufliegt, sowie eine glatte obere Kante zum Beschriften. Beschriften Sie die glatte Kante der Blöcke mit einem Bleistift; schneiden Sie ausreichend viele Blöcke zu, um die Behandlungsansätze sowie die nicht-inokulierten Kontrollen abzudecken, die sowohl als Kontaminationsschutz als auch als Basisdatenproben dienen, die parallel für ofengeeignete Materialien konditioniert werden. Geben Sie die Proben in Aluminium-Schalen und stellen Sie sie für 48 Stunden in einen Umluftofen bei 100 °C.

Überführen Sie die Proben vom Ofen in einen Exsikkator, um sie einmal abkühlen zu lassen. Abkühlen. Wiegen Sie die Proben vorab, um das anfängliche Ofentrockengewicht zu bestimmen. Bereiten Sie abschließend die Proben, einschließlich Kunststoffgittern und Holz, für die Autoklavierung vor, indem Sie sie fest mit Folie umwickeln, um eine Benetzung zu minimieren.

Dies erfordert nicht, dass jede Probe einzeln verpackt wird, wohl aber, dass die Dampfexposition niedrig und konstant ist. Sterilisieren Sie die beschrifteten Proben im Autoklaven bei 121 Grad Celsius und 16 PSI für eine Stunde. Stellen Sie in einem sterilen Biosicherheitswerkbank leere AEs, eine Quellplatte für Inokulum-Mesh-Pflanzsubstrat-exogene Materialien, Sharpie-Paraform-Streifen, Pinzette und Transfertools zusammen.

Der nächste Schritt der Inokulation besteht darin, die Materialien der Agarplatte hinzuzufügen und Petrischalen zu verwenden, um das Kontaminationsrisiko zu minimieren. Sterilisieren Sie die Übertragungswerkzeuge und Pinzetten mit 95 % Ethanol, während Sie sie verwenden. Fügen Sie zuerst das Plastikgitter der Petrischale hinzu.

Dann hier das Holzsubstrat hinzufügen. Entlang der Länge des Netzes werden zwei Holzblöcke platziert, damit Daten aus der frühen und späten Ernte miteinander verknüpft werden können. Diese Blöcke werden nebeneinander mit Maserung und mit der Stirnseite in Richtung der Quelle des Pilzinokulums ausgerichtet.

Fügen Sie als Nächstes die exogenen Materialien hinzu. Hier wird die Rolle von Gips bei der Zersetzung durch einen fadenförmigen Pilz untersucht. Daher sollte der Pilz auf diese Gipsplättchen stoßen, bevor er das Holz erreicht.

Ein Gipsplättchen wird zwischen jeden Block und Inokulationspunkt auf dem Netz gelegt. Achten Sie darauf, den Kontakt zwischen den Plättchen im Holz zu vermeiden, während sie eng beieinanderliegen. Für das Pilzinokulum verwenden Sie einen Korkbohrer der Größe vier mit sieben Millimeter Durchmesser, um Zapfen aus zweiwöchigen Kulturen zu gewinnen, die in 20 Millilitern Agar gezüchtet wurden.

Dies hilft, das Inokulumvolumen zu kontrollieren. Für nicht inokulierte Kontrollen ist es am besten, einen Zapfen von einer sterilen Platte hinzuzufügen. Vermeiden Sie den Kontakt zwischen Inokulum und den exogenen Substraten oder dem Holz, platzieren Sie sie jedoch nahe beieinander.

Verwenden Sie einen Inokulum-Plug pro Block. Verschließen Sie die Petrischalen mit Parafilm, das mit einem Rasiermesser geschnitten wurde; halten Sie die Platten horizontal und wickeln Sie das Parafilm in einer gleichmäßigen, kontinuierlichen Bewegung ein. Beschriften Sie abschließend die Schalendeckel mit einem alkoholresistenten Marker, indem Sie die Blocknummern direkt über den jeweiligen Substraten anbringen.

Zeichnen Sie außerdem Kreise über die Gipsplättchen. Überführen Sie die Platten vorsichtig in einen biologischen Inkubator, um Erschütterungen des Inhalts zu vermeiden und Kondensation aufgrund von Temperaturschwankungen zu minimieren. Die hier verwendeten Bedingungen betragen 20 Grad Celsius und Dunkelheit; führen Sie Zeitreihenernten aseptisch durch, mit Ausnahme der letzten Ernte.

Zum Erntetermin in der fünften Woche das gesamte Behandlungs-Set entfernen. Jede Unter- und Oberseite mit 70 % Ethanol besprühen und mit angeflammtem Pinzettengriff das Material im Sicherheitswerkbankinneren entnehmen. Vor dem Vernichten der Agarplatten Bilder aufnehmen, wobei besonderer Fokus auf jeglicher morphologischer Form oder Melone liegen sollte.

Entfernen Sie anschließend die zu behandelnden Blöcke. Rollen Sie überschüssiges Pha ab, achten Sie jedoch darauf, kein zersetztes Material im Ofen zu verlieren. Trocknen Sie die Blöcke in Aluminiumwannen und ermitteln Sie den Massenverlust anhand der frischen und trockenen Gewichte der Kontrollen, um ein übermäßiges Einwickeln zu überwachen.

Massenverlustdaten helfen dabei, den Zersetzungsfortschritt einzuschätzen, und stellen wichtige Informationen dar. Falls Elementalkonzentrationen bezogen auf ein Grammgewicht berechnet werden sollen, müssen Prozentangaben normalisiert werden. Für die Statistik dunkelbraune Blöcke kennzeichnen und verfolgen, die eindeutig wassergesättigt sind.

Zerstören Sie die Kulturen schließlich in autoklavierbaren Beuteln und bewahren Sie das Kunststoff-Stützgitter sowie alle anderen wiederverwendbaren Komponenten für zukünftige Experimente auf. Bei der Agri-Block-Mikrokosmos-Anordnung ruhen Kiefernholzblöcke auf einem Kunststoffgitter, wodurch sie über dem Agri-Material angehoben sind. Runde Crains wuchsen in direktem Kontakt mit den Gipsflächen und in die Holzblöcke hinein.

Dieses Myzel stellt eine wichtige Verbindung zwischen Holz und exogenen Nährstoffquellen dar. Die Kontrolle dieser exogenen Materialquellen im Agar oder in festen Materialien ist ein entscheidender Vorteil eines Agar-Block-Designs gegenüber einem Boden-Block-Design, gemessen als mittlerer prozentualer Gewichtsverlust als Indikator für das Ausmaß des Holzabbaus durch Serpula lacrymans nach fünf und 15 Wochen. Die Inkubation mit Kiefer in Agar-Block-Mikrokosmen ist hier dargestellt.

Es wurden keine Behandlungen durchgeführt. Fünf Millimolar Calciumchlorid wurden zu Agar hinzugefügt, der aus mehr als 99 % reinem Gips oder aus 1 % Eisen angereichertem Gips bestand; Erntebalken unter dem gleichen Buchstaben unterscheiden sich nicht signifikant. Unter Berücksichtigung der Fehlerbalken, die die Standardabweichung darstellen, wurde bei den kontrollierten braunfäuligen Kiefernproben ein Gewichtsverlust von mehr als 60 % beobachtet, was dem Standardziel der American Society for Testing and Materials von mehr als 50 % Zersetzungsgrad entspricht.

Der durchschnittliche Variationskoeffizient beim Zerfall betrug in Woche 16 0,055. Zusätzlich zu der geringen Variabilität wurde ein Behandlungseffekt beobachtet. Der Pilzzerfall wurde durch Kalziumzugaben gehemmt, unabhängig davon, ob diese als Calciumchlorid zum Agar oder als reiner Gips hinzugefügt wurden.

Interessanterweise steigen die Zersetzungsraten mit der Zugabe von Eisen zum Gips wieder an. Dies legt nahe, dass Eisen – nicht Kalzium – entscheidend ist, um die fünf Wiederholungen in der 15. Woche der Zersetzung unter Verwendung desselben braunfäulniserregenden Testpilzes und kreisförmiger Laminate zu beobachten. Die Farbe des Myzels offenbart mein.

Unterschiede in den äußeren Hyphen zwischen den Behandlungen; die Blöcke wurden entfernt und nach oben getrocknet. Dies zeigte den Mangel an Mein in der kalziumfreien Behandlung auf. Die Vergilbung in den reinen Kalziumbehandlungen und das rostähnliche Erscheinungsbild in der eisenangereicherten Behandlung.

Die Kontrolle repräsentiert nicht inoculierte Blöcke zum Vergleich. Interessanterweise gehen die Effekte bei Verwendung eines eisenreichen Mediums verloren. Insgesamt legt dies nahe, dass dieser Pilz Eisen, nicht aber Calcium nutzt.

In diesen Materialien haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie man eine Bohrmeißel-Block-Anordnung verwendet, um den biologischen Abbau von Pflanzengeweben durch aerobe filamentöse Pilze erfolgreich zu testen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass die Substrate nicht miteinander in Kontakt kommen, insbesondere das Pflanzengewebe und der Bohrmeißel, um den Feuchtigkeitsgehalt des Bohrmeißels und der Plättchen zu minimieren, und es ist darauf zu achten, dass sich der Inhalt der einzelnen Platten vor der Inkubation nicht verschoben hat. Wenn Sie diese Variablen berücksichtigen, können Sie die Zersetzungsbedingungen deutlich besser kontrollieren als bei Verwendung einer Bodenblock-Anordnung.

Sie können Daten mit einer statistischen Power erzeugen, die erforderlich ist, um Ihre Forschungsfragen zu beantworten. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.