Proteinkristallisation für X-ray Crystallography

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, hier Protein-Kristalle für Röntgenbeugungsexperimente herzustellen. Es werden drei verschiedene Techniken zur Kristallisationsscreening vorgestellt: Dampfdiffusionskristallisationsverfahren, einschließlich Hänge-Tropfen- und Sitz-Tropfen-Methode, sowie Mikro-Partikel-Kristallisationsverfahren für die Dampfdiffusionskristallisation. Die Mulden werden mit Präzipitant gefüllt.

Dann wird eine hohe Konzentration der gereinigten Proteinprobe mit dem Fällungsmittel vermischt. Der gemischte Tropfen wird anschließend in einer Vertiefung versiegelt, die die Fällungslösung enthält. Die Mikro-Probengravitations-Kristallisation beginnt mit dem Befüllen der Vertiefung mit Paraffinöl.

Das Protein wird dann in die Vertiefungen gegeben, gefolgt von der Fällungslösung. Der letzte Schritt aller Methoden besteht darin, das System equilibrieren zu lassen und das Auftreten und Wachstum der Kristalle in den Tropfen zu verfolgen. Letztendlich können mittels dieser Technik Kristalle erhalten werden, und das Beugungsmuster des Proteins kann mithilfe einer Röntgenquelle mit einem geeigneten Detektor bestimmt werden.

Hallo, ich bin Sal aus dem Labor von Professor Yoga Motis am Fachbereich Molekulare Biophysik und Biochemie der Yale University. Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Kristallisation eines gereinigten Proteins. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um die strukturelle Grundlage der Virusinfektion zu untersuchen.

Kommen wir also dazu, einige Kristalle wachsen zu lassen. Um eine Kristallisationsmethode für ein beliebiges Makromolekül zu identifizieren, können anfängliche Screenings mit kommerziell verfügbaren Kristallisationslösungen durchgeführt werden, die so ausgewählt sind, dass sie die Methode der spärlichen Matrix mit unvollständigem Faktoriellenansatz für Versuchsbedingungen nutzen. Diese Bedingungen werden basierend auf bekannten und häufig erfolgreichen Kristallisationsbedingungen für Makromoleküle ausgewählt.

Wenn die Kristallisationsbedingung bekannt ist, kann ein engerer Screen zusammengestellt werden, bei dem die Konzentration des Fällungsmittels im pH-Bereich um den ursprünglichen Treffer variiert wird. Üblicherweise bestehen die für diese Screens verwendeten Kristallisationsbedingungen aus einem Fällungsmittel und einem Puffer zur Einstellung des pH-Werts; alle Stammlösungen müssen für diese Demonstration durch einen 0,22-Mikron-Filter filtriert werden. Die zuvor identifizierten Kristallisationsbedingungen für Hühnerlysozym werden verwendet, wobei Natriumchlorid als Fällungsmittel dient. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie einteilige Milliliter-Lösungen verschiedener Konzentrationen von Natriumchlorid in 0,1-molarer Natriumacetat-Lösung bei verschiedenen pH-Werten herstellen.

Tauen Sie als Nächstes die Proteinprobe auf, die bei minus 80 Grad Celsius gelagert wurde, und halten Sie sie auf Eis. Typische Protein-konzentrationen liegen im Bereich von fünf bis 50 Milligramm pro Milliliter, wobei höhere Konzentrationen gewöhnlich bessere Ergebnisse liefern. Hier wird eine 50 Milligramm pro Milliliter Lösung von Hühnerei-Lysozym in 0,02 molarer Natriumacetat-Pufferlösung mit pH 4,9 verwendet.

Zentrifugieren Sie die Probe 15 Minuten bei 18.000 G und vier Grad Celsius, um teilweise aggregierte Proteine oder Niederschläge aus dem Auftauschritt zu entfernen. Diese Aggregate können das Kristallwachstum stören und weitere Aggregation fördern. Nach der Zentrifugation.

Bestimmen Sie die Proteinkonzentration anhand der Absorption bei 280 Nanometern mithilfe eines UV-Spektralphotometers. Die Proteinkonzentration kann aus dem Absorptionswert und dem Extinktionskoeffizienten des Proteins berechnet werden. Sobald die Proteinprobe vorbereitet ist, füllen Sie eine 24-Loch-Hänge-Tropfen-Kristallisationsplatte gemäß der Plattenkarte mit 500 Mikrolitern Präzipitanzlösung.

Erstellen Sie einen Silikonfett-Ring um den Rand jedes Wells, ohne den Ring vollständig zu schließen, damit Luft entweichen kann, wenn der Deckel aufgesetzt wird. Reinigen Sie den Deckel mit Druckluftspray oder einem professionellen Abwischmittel, um Staub zu vermeiden, was die Auswertung der Kristallisationsansätze erleichtert und Kontaminationen verhindert. Im nächsten Schritt pipettieren Sie gleiche Volumina der Proteinprobe und der Reservoirlösung auf den Deckel.

Es können jedoch verschiedene Volumina an Protein und Präzipitator im Rahmen des Optimierungsprozesses getestet werden; die Verwendung einer größeren Menge an Protein im Vergleich zum Präzipitator führt zu einer Netto-Konzentration des Proteins im ausgeglichenen Tropfen, was für verdünnte Proteinproben vorteilhaft sein kann oder dazu dienen kann, die Kristallkeimbildung oder das Kristallwachstum zu verlangsamen. Für diese Demonstration werden zwei Mikroliter eines 50 Milligramm pro Milliliter Lysozym in 0,02 molarer Natriumacetat, pH 4, in die Mitte des Deckgläschens pipettiert, gefolgt von zwei Mikrolitern Kristallisationslösung.

Beim Pipettieren der Protein- und Reservoirlösung auf den Deckelträger ist äußerste Vorsicht geboten, um die Bildung von Blasen zu vermeiden, die häufig auftritt, wenn Luft aus der Pipette ausgeblasen wird. Mischen Sie den Tropfen vorsichtig, um eine vorzeitige Proteinfällung aufgrund lokal hoher Fällungsmittelkonzentrationen im Tropfen zu verhindern; dieses Mischen ist besonders wichtig bei viskosen Fällungsmitteln wie Polyethylenglykol unter Verwendung von Pinzette. Drehen Sie den Deckelträger vorsichtig um und legen Sie ihn in einer gezielten Weise auf den Fettring oben auf das Bohrloch, sodass die Luft aus dem Bohrloch entweichen kann.

Andernfalls kann die Luft die Deckglasabdeckung anheben und dadurch die Abdichtung des Wells beeinträchtigen. Fahren Sie mit dem nächsten Well fort, bis die gesamte Platte befüllt ist. Sobald die Platte eingerichtet ist, überprüfen Sie sie visuell und entfernen Sie Staubpartikel sowie andere Verunreinigungen, die zu falsch-positiven Identifizierungen von Protein-Kristallen führen können.

Verwenden Sie ein Bewertungsblatt, um das Experiment zu dokumentieren. Stellen Sie anschließend die Schale auf die gewünschte Inkubationstemperatur, die im Allgemeinen zwischen vier Grad Celsius und Raumtemperatur liegt. Die erfolgreichste Temperatur beträgt 20 Grad Celsius.

Beachten Sie, die Schale vorsichtig zu handhaben, und vermeiden Sie Erschütterungen oder Temperaturschwankungen während der Übertragung oder Inkubation, da diese das Kristallwachstum verhindern oder die Kristallqualität negativ beeinflussen können. Überprüfen Sie die Schale am folgenden Tag und danach alle paar Tage auf Kristalle, wobei Sie die Schalen stets sorgfältig behandeln. Dokumentieren Sie alle Beobachtungen sowie die Tropfenmorphologien in einem spezifischen Bewertungsblatt für die Schale.

Kristalle erscheinen typischerweise innerhalb von zwei bis fünf Tagen, obwohl sie gelegentlich fast sofort oder erst nach mehreren Monaten auftreten können. Sobald die Kristallisationsbedingungen identifiziert wurden und die Wachstumsrate der Kristalle bekannt ist, ist es am besten, die Platten ungestört zu lassen, bis Kristalle erschienen sind und mindestens die Hälfte ihrer Endgröße erreicht haben. Wenn die Platten ungestört bleiben, kann die Anzahl der Kristallkeimbildungsereignisse reduziert werden, wodurch weniger, aber größere Kristalle entstehen. Für die Kristallisation aus Tropfen auf der Unterlage folgen Sie der gleichen Vorgehensweise wie bei der hängenden Tropfenmethode, mit dem Unterschied, dass eine 24-Loch-Platte für die Kristallisation aus Tropfen auf der Unterlage verwendet wird, bei der Deckgläser nicht erforderlich sind.

Stattdessen enthält die Vertiefung eine Ablage, auf der das Protein und das Fällungsmittel gemischt werden. Pipettieren Sie zwei Mikroliter einer Lysozym-Lösung mit 50 Milligramm pro Milliliter in die Mitte der Ablage, wobei die Bildung von Luftblasen vermieden werden sollte. Danach geben Sie zwei Mikroliter der Fällungslösung zur Probe hinzu, nachdem das Tablett eingerichtet wurde. Versiegeln Sie die Vertiefungen mit optischem Klebeband bei hängendem Tropfen.

Deckgläser sind nicht erforderlich. Setzen Sie die Inkubation und die Kristallauswertung wie für Tropfenverdampfung beschrieben fort. Um ein Mikro-Probenvolumen-Verfahren durchzuführen.

Bereiten Sie die Kristallisationslösung und das Protein wie für das Hänge-Tropfen-Verfahren beschrieben vor. Verwenden Sie eine neue Mikro-Partikel-Tray und besprühen Sie sie mit Luft, um Staub und andere große Partikel in der Mikro-Partikel-Tray zu vermeiden. Geben Sie Paraffinöl in jedes Loch bis zu einer Tiefe von drei Millimetern hinzu.

Entfernen Sie anschließend überschüssiges Öl. Geben Sie danach einen Mikroliter der Proteiniösung in die vorbefüllte Vertiefung, wobei sichergestellt werden muss, dass der Tropfen auf den Boden der Vertiefung absinkt. Fügen Sie anschließend einen Mikroliter der Präzipitatiösung in die Vertiefung hinzu.

Stellen Sie sicher, dass der Tropfen bis zum Boden der Vertiefung absinkt und mit dem Proteintropfen verschmilzt. Wechseln Sie zur nächsten Vertiefung, bis die Platte vollständig befüllt ist, und fahren Sie mit der Inkubation und Kristallanalyse wie hier beschrieben fort. Typische Ergebnisse der Protein-Kristallisation.

Es werden Experimente gezeigt. Es bildet sich eine amorphe Fällung, wenn das Protein und/oder das Fällungsmittel in hoher Konzentration vorliegen. Umgekehrt bleiben Tropfen, die ungesättigt sind, gewöhnlich klar.

Phasenseparation kann auftreten, wenn das Protein oder das Detergens sich bei hoher Konzentration mit bestimmten Fällungsmitteln in eine separate Phase absondert. Unter optimalen Bedingungen sollten Protein-Kristalle Arabidopsis csn bilden. Sieben Protein-Kristalle, die in Polyethylenglykol 8.000 und Magnesiumacetat erhalten wurden, erscheinen stabförmig.

Abgebildet sind außerdem Lysosomen-Proteinkristalle, die in einer molaren Lösung aus Natriumchlorid und Natriumacetat bei pH 4,9 erhalten wurden. Dieser Zeitrafferfilm zeigt, dass Lysosomenkristalle innerhalb weniger Stunden nach dem Aufsetzen der Hänge-Tropfen-Methode zu großen Prismen anwachsen.

Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man ein Proteinexperiment einrichtet, wenn Sie dieses Verfahren durchführen. Es ist wichtig, in einer Umgebung mit konstanter Temperatur- und Feuchtigkeitskontrolle zu arbeiten, da hohe Luftfeuchtigkeit die Verdunstung der Tropfen minimiert. Versuchen Sie, eine Technik anzuwenden, die die Belüftung des Tropfens mit der offenen Luft minimiert. Aus diesem Grund ist es unerlässlich, in einer gut organisierten Arbeitsumgebung zu arbeiten.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.