Stabilen Isotopen Profiling von Intermediary Metabolic Flux in Entwicklungs-und Erwachsenen-Stadium Caenorhabditis elegans

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, nichtinvasiv in Echtzeit Stoffwechselveränderungen auf der Ebene des gesamten Organismus im Bereich der Glykolyse, des Pyruvatstoffwechsels und des Tricarbonsäurezyklus zu überwachen, die durch einzelne Stoffwechselwege, genetische Veränderungen und/oder pharmakologische Behandlungen verursacht werden. Dies wird erreicht, indem lebenden Fadenwürmern stabile Isotope verabreicht werden, um eine ausreichende isotopische Anreicherung in einer größeren Zahl von Metaboliten zu erzielen, die eine Quantifizierung genetischer und/oder pharmakologischer Veränderungen in intermediären Stoffwechselwegen ermöglicht. Als zweiter Schritt werden die Einlagerung von Isotopen in atmosphärisches und gelöstes Kohlendioxid mittels Gasisotopenverhältnis-Massenspektrometrie gemessen, was eine direktere Beurteilung des intermediären Stoffwechselflusses über kurze Zeiträume hinweg ermöglicht.

Anschließend werden die Proben zur Analyse freier Aminosäuren im gesamten Wurm mittels HPLC sowie durch isotopische Anreicherung in Aminosäuren und organischen Säuren mittels GC-MS bearbeitet, um Veränderungen des metabolischen Flusses in Nematoden zu quantifizieren. Nach der Exposition gegenüber stabilen Isotopen werden Ergebnisse erhalten, die die Effekte variabler Dauer der Isotopenexposition, der bakteriellen Eliminierung und alternativer Wurmlyse in Wildtyp-Würmern zeigen, um die isotopische Anreicherung in intermediären Metaboliten zu untersuchen. Diese Methode kann Einblicke in die Regulation der intermediären Stoffwechselwege liefern.

Es kann auch auf unsere Systeme wie Säugerzelllinien und Gewebe angewendet werden. Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich, als wir bei der Analyse freier Aminosäuren in Würmern mittels HPLC konsistente Auffälligkeiten beobachteten, die auf eine beeinträchtigte intermediäre metabolische Flussrate bei primären respiratorischen Veränderungen der Funktion hindeuteten. Um dieses Verfahren zu beginnen.

Würmer, die entweder während der Entwicklung oder im Erwachsenenalter einem stabilisotopenmarkierten metabolischen Vorläufer ausgesetzt wurden, werden in einem 1,5-Milliliter-Kunststoffzentrifugenröhrchen gesammelt. Üblicherweise verdünnen wir die Würmer auf eine Konzentration von 1000 Würmern pro Milliliter. Geben Sie 60 %ige Perchlorsäure, die epsilon-Aminocapronsäure als internen Standard enthält, zu den Würmern hinzu, um eine Endkonzentration von 4 %iger Perchlorsäure und 20 Nanomolar internem Standard zu erreichen.

Lassen Sie den Wurm fünf Minuten lang durch die Schwerkraft absetzen, dann entfernen und bewahren Sie den Überstand in einem anderen Gefäß auf. Der folgende Schritt ist einer der kritischsten Aspekte dieses Verfahrens. Die Würmer müssen vor der Analyse freier Metaboliten vollständig durch Siebung zerkleinert werden. Mahlen Sie die Wurmproben mit einem Plastikhomogenisator und einem motorisierten Bohrer 15 Sekunden lang.

Bestätigen Sie visuell die Wurmdisruption durch Lichtmikroskopie und wiederholen Sie das Zermahlen gegebenenfalls. In diesem Bild zeigen die Felder A und B Würmer vor dem Zermahlen. Im Gegensatz dazu zeigen die Felder C und D Würmer nach dem Zermahlen; überführen Sie anschließend das zuvor aufbewahrte Überstandsvolumen in 1,5-Milliliter-Kunststoffzentrifugenröhrchen mit dem Wurmhominat und zentrifugieren Sie.

Zentrifugieren Sie die Proben bei 2.250 U/min, 1300 ×g, fünf Minuten lang. Nach der Zentrifugation überführen Sie den Überstand in ein frisches sieben Milliliter fassendes Glasröhrchen. Bewahren Sie das Pellet für spätere Verwendung in einem Protein-Konzentrations-Assay auf.

Geben Sie nun vier normales Kaliumhydroxid zum Überstand, bis der pH-Bereich der Proben sieben bis acht beträgt, und zentrifugieren Sie. Zentrifugieren Sie die neutralisierten Proben in den sieben Milliliter fassenden Glasröhrchen bei 2.250 U/min (1.300 ×g) fünf Minuten lang. Um Salze zu entfernen, überführen Sie den Überstand jeder Probe in ein neues sieben Milliliter fassendes Glasröhrchen. Die neutralisierten Proben können nun zur Metabolitenquantifizierung mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie oder HPLC sowie Gaschromatographie-Massenspektrometrie oder GC-MS für HPLC vorbereitet werden.

Trennen Sie 50 Mikroliter jeder neutralisierten Probe zur direkten Injektion in die HPLC ab. Die Quantifizierung freier Aminosäuren erfolgt mittels vorab durchgeführter Derivatisierung mit Al-Dehyd und fluorimetrischer Detektion. Wie zuvor beschrieben, werden die verbleibenden neutralisierten Proben einer Extraktion mittels Ionenaustauschharz für die GC-MS unterzogen, um die isotopische Anreicherung in Aminosäuren und organischen Säuren zu bestimmen, wie im nächsten Abschnitt dargestellt.

Um die Kugeln vorzubereiten, geben Sie eine normale Salzsäure separat zu G 1 und G 50 Kugeln hinzu. Rühren Sie in Ein-Liter-Bechern jeden Kolben 30 Minuten lang mit einem Magnetrührer um. Danach spülen Sie die Kugeln 10-mal mit entionisiertem Wasser, bis der pH-Wert der Abwässer dem pH-Wert des Wassers entspricht.

Danach zeigen wir unsere Methode zur Herstellung maßgeschneiderter, kostengünstiger Säulen unter Verwendung von Glaspipetten. Fertigsäulen sind ebenfalls im Handel erhältlich. Um eine Säule herzustellen, verwenden Sie eine Pinzette, um einen Wattebausch direkt oberhalb des engsten Teils einer Pasteur-Pipettenspitze einzubringen, und verwenden Sie G-one-Perlen zur Extraktion organischer Säuren sowie G-50-Perlen.

Füllen Sie für die Aminosäure-Extraktion jede Säule bis zu etwa einem Drittel der Säulenhöhe. Wenn eine Probe bereits bei neutralem pH-Wert vorliegt, wird vor der Applikation auf die AG 1-Säule nichts zur Probe gegeben. Um organische Säuren zu extrahieren und Aminosäuren zu gewinnen, geben Sie ein Milliliter 0,1 normaler Salzsäure zur Probe hinzu, bevor Sie sie auf die AG 50-Säule auftragen.

Tragen Sie nun die zuvor hergestellten neutralisierten Proben auf jede Säule auf. Waschen Sie jede Säule zehnmal mit Wasser, bis die Waschflüssigkeit neutral ist. Nach Abschluss des Waschvorgangs eluieren Sie jede Säule in frische, beschriftete Glasprobenfläschchen mit vier Milliliter Inhalt. Für die Extraktion organischer Säuren geben Sie drei Milliliter dreifach normaler Salzsäure zur AG-eins-Säule hinzu.

Dies ermöglicht die Analyse der Isotopenanreicherung in der Gesamtanzahl markierter Kohlenstoffatome unter dreiatomigen, vieratomigen, fünfatomigen und sechsatmigen Kohlenstoffverbindungen. Für die Aminosäure-Extraktion drei Milliliter vierfach normaler Ammoniumhydroxidlösung zu einer G-50-Säule hinzufügen. Dies ermöglicht die Analyse der Isotopenanreicherung in der Gesamtanzahl markierter Kohlenstoffatome unter dreiatomigen und fünfatomigen Kohlenstoffverbindungen.

Nach Abschluss der Extraktionen von organischen Säuren und Aminosäuren die Probenröhrchen über Nacht in einen Drehverdampfer geben, bis sie trocken sind. Die Proben werden anschließend versetzt und gemäß dem im Protokolltext beschriebenen Verfahren durch GC-MS analysiert. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie tausend junge adulte Würmer auf eine experimentelle 35-Millimeter-NGM-Agarplatte mit universell markiertem Kohlenstoff-13-Glukose und E. coli überführen.

Platzieren Sie als Nächstes die experimentelle NGM-Platte ohne Deckel in einer speziellen Glaswanne, die mit einem gut abgedichteten Dreiweghahn ausgestattet ist, um eine präzise Atmosphärenentnahme und -erneuerung zu ermöglichen. Versiegeln Sie die Stelle, an der die optisch transparente Glasplatte auf der Platte aufliegt, mit Hochvakuumfett.

Versiegeln Sie die Kammer mit der Glasplatte. Notieren Sie den Zeitpunkt. Nehmen Sie 30 Minuten später, bezogen auf den Zeitpunkt null, mit einer 20-Milliliter-Spritze 10 Milliliter der Atmosphäre aus der Glaswanne über den Dreiweghahn ab.

Schließen Sie den Hahn zur Kammer. Überführen Sie die Probe nach der Entnahme in ein vakuumiertes Glasröhrchen mit rotem Verschluss, das ein Milliliter Natriumbicarbonat in 0,1-molarer Natriumhydroxidlösung enthält. Danach injizieren Sie zehn Milliliter Luft über den Dreiweghahn in die Glas­kammer. Schließen Sie unter Verwendung einer 20-Milliliter-Spritze den Hahn zur Kammer, nachdem Sie erneut Atmosphäre injiziert haben, und wiederholen Sie vor Fortsetzung der Inkubation die Entnahme von Atmosphäre aus der Glas­kammer nach 60, 90 und 120 Minuten.

Analysieren Sie diese atmosphärischen Kohlendioxidproben hinsichtlich der Markierung mit angereichertem Kohlenstoff unter Verwendung eines Gas-Verhältnis-Massenspektrometers, wie im Protokolltext beschrieben. Stabile Isotope sind nach zwei Stunden gut in junge erwachsene Würmer eingebaut, wie hier durch markierten Kohlenstoff in atmosphärischem Kohlendioxid und gelöstem Wurmkohlendioxid bei Würmern nachgewiesen, die entweder lebende oder durch UV-Bestrahlung abgetötete OP50 E. coli erhalten hatten. Das Verhältnis von Kohlenstoff-13-Kohlendioxid zu Kohlenstoff-12-Kohlendioxid war in der Fraktion des gelösten Wurmkohlendioxids höher als im freigesetzten atmosphärischen Kohlendioxid. Es wurde beobachtet, dass eine verlängerte Exposition gegenüber einem stabilen Isotop ab der Larvenphase sowie anschließendes Ausspülen der Würmer auf NGM-Agar ohne Bakterien die isotopische Anreicherung von freiem Glutamat in jungen erwachsenen Würmern erhöhte.

In diesem Diagramm steht L1 für Würmer, die ab dem L1-Larvenstadium bis zum jungen Erwachsenenstadium mit 959 Zellen (YA) mit universell markiertem Kohlenstoff-13-Glukose und OP50-Bakterien gefüttert wurden, und YA steht für Würmer, die 48 Stunden lang mit Kohlenstoff-13-Glukose und OP50-Bakterien gefüttert wurden, beginnend am ersten Tag der Eiablage im jungen Erwachsenenstadium. Die x-Achse zeigt die Gesamtanzahl der markierten Kohlenstoffatome in jeder Glutamatart an, und die y-Achse zeigt die prozentuale Anreicherung an. Alle Tiere wurden vor der weiteren Probenvorbereitung von überschüssiger isotopischer Markierung befreit.

Für GC-MS-Analysen zeigen die grünen Balken Würmer an, die nach der isotopischen Exposition durch Fütterung mit OP50 E. coli auf NGM-Platten zwei Stunden vor der PCA-Extraktion entleert wurden. Die blauen und grauen Balken zeigen Würmer an, die nach der isotopischen Exposition zwei bzw. sechs Stunden vor der PCA-Extraktion auf NGM-Platten ohne Bakterien entleert wurden, unabhängig vom Zeitverlauf der isotopischen Exposition. Es wurde kein signifikanter Unterschied in der isotopischen Anreicherung in intermediären Metaboliten beobachtet, wenn die Tiere entweder zwei oder sechs Stunden auf den Platten entleert wurden.

Bei beiden isotopischen Expositionsvarianten wurde eine geringere isotopische Anreicherung in intermediären Metaboliten beobachtet, wenn die Tiere zwei Stunden lang mit nicht markierten Bakterien gefüttert wurden. Daher wurde als optimales Clearance-Protokoll für Würmer, die auf mit Isotopen versetzten bakteriell beimpften NGM-Platten gezüchtet wurden, ein zweistündiges Clearance auf unbeimpften NGM-Platten festgelegt, um die prozentuale Anreicherung in intermediären Metaboliten zu maximieren. Nach einer 24-stündigen Behandlung in Flüssigkultur mit einem sechskohlenstoffhaltigen 13C-Glukose ohne Bakterien.

Es wurde ein Vergleich zwischen Wurmproben durchgeführt, die allein durch Sonikation oder durch Sonikation in Kombination mit Mahlung disruptiert wurden, wie in dieser Abbildung dargestellt. Würmer, die durch Sonikation in Kombination mit Mahlung disruptiert wurden, wiesen eine stärkere isotopische Anreicherung auf als Proben, die ausschließlich durch Sonikation disruptiert wurden, wobei lebende Würmer abschließend entweder während der Entwicklung ab dem L1-Stadium auf Platten oder ab dem ersten Tag der Eiablage als junge adulte Tiere für 24 Stunden in Flüssigkultur mit einem stabilen isotopischen Vorläufermolekül gefüttert wurden. Dies ermöglicht eine empfindliche Analyse der isotopischen Anreicherung in Metaboliten, die für den Fluss durch die Glykolyse und den Pyruvatstoffwechsel im Tricarbonsäurezyklus nach der Entwicklung aussagekräftig sind.

Diese Technik ebnete den Weg für die Erforschung des intermediären Stoffwechselumsatzes bei C. elegans im Bereich der mitochondrialen Erkrankungen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die stabile Isotopenanalyse zur Untersuchung des intermediären Stoffwechsels und des metabolischen Flusses bei den Fadenwürmern C. elegans durchgeführt wird.