Hochauflösende LWL-Mikroendoskopiesysteme für In situ Cellular Imaging

Traditionell wurden biologische und klinische Studien, die eine mikroskopische Analyse auf zellulärer Ebene erfordern, durchgeführt, indem mehrere Experimente parallel durchgeführt wurden, wobei einzelne Proben zu sequenziellen Zeitpunkten aus der Studie entnommen und mittels Lichtmikroskopie ausgewertet wurden, während die konfokale, die Mehrphotonen- sowie die Mikroskopie der zweiten Harmonischen alle nützliche Techniken zur Bildgebung in situ darstellen. Die erforderliche Infrastruktur ist komplex und teuer und beinhaltet Abtastlasersysteme sowie komplexe Lichtquellen. Hier zeigen wir, wie man innerhalb eines einzigen Tages mithilfe von handelsüblichen Komponenten für unter 5.000 US-Dollar ein hochauflösendes faseroptisches mikroendoskopisches System aufbaut.

Die Plattform bietet Flexibilität hinsichtlich Bildauflösung, Gesichtsfeld und Betriebswellenlänge. Zunächst wird ein einfacher Aufbau für ein Epi-Fluoreszenzmikroskop zusammengestellt, der eine Lichtquelle, optische Filter, Linsen, ein faseroptisches Bündel und eine CCD-Kamera aufnimmt. Anschließend werden die Abbildungslinsen installiert, die ein vergrößertes Bild des faseroptischen Bündels auf der CCD-Kamera erzeugen.

Als Nächstes wird eine LED-Quelle mit Beleuchtungsoptik installiert, um die Probe mit fluoreszenter Anregungsbeleuchtung zu versorgen. Schließlich ermöglicht die zusammengesetzte mikroskopische Endoskopie in Echtzeit die Darstellung zellulärer Details fluoreszenzmarkierter Proben, einschließlich in vitro-Kulturen, in vivo-Tiermodelle und menschliche Probanden. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie der konfokalen oder Multiphotonen-Mikroskopie besteht darin, dass sie ausreichend einfach und kostengünstig ist, sodass Forscher in einer Vielzahl von Fachgebieten sie schnell umsetzen und an ihre spezifischen Anforderungen anpassen können.

Das hier beschriebene hochauflösende Mikroendoskop sollte als Basiskonfiguration betrachtet werden, bei der mehrere Varianten in Aufbau und Anwendung möglich sind. Bei der Auswahl der Komponenten für eine spezifische Anwendung sollten die inhärenten Zusammenhänge in der Fluoreszenzmikroskopie zwischen Fluorolkonzentration, Photobleichung, Beleuchtungsintensität, Kamerempfindlichkeit, Verstärkung und Belichtungszeit berücksichtigt werden. Diese Plattform ist darauf ausgelegt, mit Proflavin als fluoreszierendem Kontrastmittel verwendet zu werden, kann jedoch auch für andere fluoreszierende Farbstoffe konfiguriert werden.

Proflavin ist ein leuchtender Kernfarbstoff mit Absorptions- und Emissionswellenlängenmaxima bei 445 Nanometern bzw. 515 Nanometern. Bei Verwendung anderer Kontrastmittel muss der Anwender Anregungs-, Emissions- und dichroitische Filter entsprechend auswählen, um das Mikroendoskop-System zusammenzubauen. Verbinden Sie zunächst zwei sechs Zoll lange Käfigstangen mit zwei 1,5 Zoll langen Käfigstangen, um ein Paar 7,5 Zoll lange Stangen zu bilden. Schrauben Sie die Stangen in eine Seite der Faltspiegel-Einheit ein und installieren Sie dann einen Spiegel mit einem Durchmesser von einem Zoll.

Danach vier 0,5-Zoll-Stäbe in die gegenüberliegende Fläche der Falbspiegeleinheit einschrauben. Den Käfigwürfel über die beiden unteren Durchgangslöcher auf die 7,5-Zoll-Käfigstäbe schieben. Die zwei Zoll langen Stäbe in die Seitenfläche des Käfigwürfels einschrauben.

Verwenden Sie einen C-Mount-auf-SM1-Adapter, um die Kamera an einer Käfigplatte zu befestigen. Befestigen Sie die Käfigplatte an den 0,5-Zoll-Käfigstäben bündig mit der Stirnseite der Umlenkspiegeleinheit. Wählen Sie ein Objektivrohr mit einem Durchmesser von einem Zoll, um ein Bild des faseroptischen Bündels auf der Kamera zu erzeugen.

Die Brennweite der Linse sollte so gewählt werden, dass die Ursache des Lichtleiterbündels von mindestens zwei Pixeln erfasst wird. Wenn das Bild auf die Kamera projiziert wird, setzen Sie die Linse in ein drei Zoll langes Linsenrohr ein und befestigen Sie sie mit einem Sicherungsring. Ein Spannenschlüssel ist hilfreich, um Sicherungsrings in lange Linsenrohre einzuschrauben.

Legen Sie den Emissionsfilter in das drei Zoll messende Linsenrohr auf die Oberseite des ersten Sicherungsringes und fügen Sie einen weiteren Ring hinzu, um den Filter zu befestigen. Stellen Sie sicher, dass die Orientierung des Filters der vom Hersteller angegebenen Konvention entspricht. Schrauben Sie das Linsenrohr in die Seite des Käfigwürfels ein, die der CCD-Kamera am nächsten liegt.

Diese Position ist hier ebenfalls dargestellt. Beachten Sie, dass in der Abbildung dieses Objektiv und dieser Filter ohne den drei Zoll langen Objektivtubus gezeigt werden. Der Einfachheit halber schließen Sie die Kamera an einen Computer an und betrachten das Bild auf dem Bildschirm.

Richten Sie die Käfiganordnung auf ein entferntes Objekt aus, und schieben Sie den Käfigwürfel entlang der Schienen, bis ein scharfes Bild des Objekts erscheint. Ziehen Sie mit einem Schraubendreher die vier an den Seiten des Käfigwürfels befindlichen Schrauben fest. Diese Schrauben greifen bei festem Anziehen in die Schienen ein und halten den Würfel in Position.

Dadurch wird sichergestellt, dass die Tubuslinse ein scharf fokussiertes Bild des Faserbündels auf der Kamera erzeugt, wenn sie mit der auf Unendlich korrigierten Objektivlinse kombiniert wird. Danach wird der DIC-Spiegel in den Halter eingesetzt und im Käfigwürfel in einem Winkel von 45 Grad positioniert. Das Objektiv wird über einen RMS-zu-SM-Einschraubadapter und ein verstellbares Linsenrohr in die dem Tubuslinse-Halter gegenüberliegende Seite des Käfigwürfels eingeschraubt.

Danach eine SMA-Buchse auf eine Käfigplatte schrauben und diese ungefähr in der Arbeitsentfernung der Objektivlinse an den Stäben befestigen. Die Basisplatte und die Endkappe an den offenen Seiten des Käfigwürfels anbringen. Anschließend eine LED auf einer Käfigplatte montieren und sie auf das Ende der Zoll-Stäbe schieben.

Fügen Sie eine Linse in ein 0,5-Zoll-Linsenrohr ein, sodass beim Einschrauben dieses Rohrs in die Seite des Käfigwürfels ein Bild der LED entsteht, das die hintere Apertur der Objektivlinse ausfüllt. Bringen Sie außerdem den Anregungsfilter am Linsenrohr an. In diesem Stadium kann ein LED-Treiber verwendet werden, um die Intensität des Beleuchtungslichts mithilfe von Epoxidharz zu steuern.

Schließen Sie einen SMA-Stecker für eine 1030-Mikrometer-Faser an das 720-Mikrometer-Sichtfeld des faseroptischen Bündels an. Für Einzelheiten zur Verbindungstechnik von faseroptischen Leitern siehe T Thor Labs, Artikelnummer FN nine six. Eine Anleitung zur Verbindung und Polierung von optischen Fasern.

Schrauben Sie das SMA-Steckerverbinder-Bündel in die auf den Käfigstangen montierte SMA-Buchse ein. Richten Sie das distale Ende des Bündels auf eine Breitbandlichtquelle aus; fluoreszierende Beleuchtung ist ausreichend. Beobachten Sie anschließend das Bild der proximalen Fläche des Bündels auf der CCD-Kamera. Stellen Sie abschließend die Position der Objektivlinse ein, indem Sie sie in den Käfigwürfel hinein- oder herausdrehen.

Bis das Bild des Faserbündels scharf erscheint, sollte die einzelne Struktur deutlich sichtbar sein. Die räumliche Auflösung des Mikroendoskops kann erhöht werden, indem eine Mikrolinse oder Linsenanordnung an der distalen Spitze des Faserbündels angebracht wird. Diese Optiken sind so konfiguriert, dass die Spitze des Bündels nicht direkt auf dem Gewebe aufliegt, sondern mit einer verkleinerten Abbildung (dem Vergrößerungsfaktor) auf die Gewebeoberfläche abgebildet wird.

Dadurch wird die räumliche Abtastfrequenz erhöht, die durch die lichtleitende Wirkung des Faserbündels verursacht wird. Der Grad der Demagnifizierung entspricht der Zunahme der räumlichen Auflösung und gleichzeitig einer proportionalen Verringerung des Sichtfelds. Wählen Sie eine GRIN-Linse mit der gewünschten Vergrößerung und Arbeitsabstand für Ihre Anwendung aus.

Stellen Sie sicher, dass der Durchmesser der Linse dem des Faserbündels entspricht, mit dem Sie arbeiten möchten. Befestigen Sie das Faserbündel und die GRIN-Linse auf separaten manuellen Positionierstufen mit drei Achsen unter einem Mikroskop mit niedriger Vergrößerung oder einem Stereomikroskop, um eine genaue Ausrichtung zu gewährleisten.

Als Nächstes einen Tropfen optischen Klebstoffs entweder auf die Linse oder auf die Bündeloberfläche geben. Mithilfe der manuellen Positionierer die beiden Komponenten in Kontakt bringen. Die Grenzfläche der empfohlenen Dosis UV-Licht gemäß Herstellerangaben aussetzen, um den Klebstoff zu aushärten.

Um die Grin-Linse und die verklebte Schnittstelle zu schützen, verwenden Sie ein kurzes Stück Aluminium-Kapillarrohr, um die Verbindung zu umschließen. Schieben Sie das Rohr über die Verbindung und befestigen Sie es mit einem Tropfen Epoxidharz an jedem Ende des Rohrs; verwenden Sie Schrumpfschlauch, um die Montage abzuschließen. Vor der mikroskopischen endoskopischen Bildgebung tragen Sie das Kontrastmittel auf die zu bildgebenden Zellen oder das Gewebe auf, um Zellen und Kultur abzubilden.

Entfernen Sie zunächst das Wachstumsmedium durch Pipettieren. Geben Sie dann die Pro-Flavin-Lösung vorsichtig durch Pipettieren in die Vertiefung. Nach einer kurzen Inkubation von bis zu einer Minute entfernen Sie die Pro-Flavin-Lösung durch Pipettieren und entsorgen Sie diese.

Spülen Sie die Zellen, indem Sie frische PBS-Lösung hinzufügen und wieder entfernen. Befestigen Sie das distale Ende des Faserbündels in einer sicheren Halterung mit manuellen Positionierstufen auf der X-, Y- und Z-Achse, um Stabilität zu gewährleisten. Während der Bildaufnahme nach Applikation des Farbstoffs auf Zellen oder Gewebe bringen Sie das faseroptische Bündel leicht in Kontakt mit der Probe. Betrachten Sie das Bild des faseroptischen Bündels auf dem Computerbildschirm, entweder mithilfe der Software des Kameraherstellers oder einer benutzerdefinierten Software, die Sie ggf. entwickeln möchten.

Stellen Sie die Belichtungszeit und die Verstärkungseinstellungen der Kamera so ein, dass ein Bild mit akzeptabler Helligkeit erzielt wird. Bei korrekter Montage arbeitet das Mikroendoskop als epifluoreszenzmikroskopisches System, das über ein kohärentes faseroptisches Bündel weitergeleitet wird. Für optimale Bildgebungsresultate sollte darauf geachtet werden, dass drei wesentliche Bedingungen erfüllt sind.

Zunächst sollte die proximale Fläche des Faserbündels ohne Defokus auf die CCD-Kamera abgebildet werden, um die volle Auflösung des Systems zu erreichen. Hier ist ein Teil eines Faserbündels mit schlechtem, leichtem und gutem Fokus abgebildet. Der optimale Fokus wird durch Einstellung der tatsächlichen Position der Objektivlinse relativ zur Bündeloberfläche gefunden.

Zweitens sollte die proximale Fläche des Faserbündels über den gesamten Durchmesser gleichmäßig beleuchtet werden. Wie bereits beschrieben, wird dies durch Konfiguration der Beleuchtungsoptik für Kolleimatorbeleuchtung erreicht. Das hier gezeigte Bild wurde aufgenommen, als eine homogene fluoreszierende Probe in dieser bevorzugten Konfiguration beleuchtet wurde.

Das entsprechende Ergebnis unter kritischer Beleuchtung ist hier dargestellt. Die Struktur der LED wird auf die Stirnfläche des Faserbündels abgebildet, was zur Überlagerung dieses unerwünschten Musters auf der eigentlichen Probendetails führt. Drittens ist es wichtig sicherzustellen, dass sowohl die proximale als auch die distale Stirnfläche des Faserbündels sauber sowie frei von Kratzern und Absplitterungen ist.

In diesem Beispiel ist Bildrauschen an der Bündeloberfläche angebracht, und am Faserumfang ist eine Beschädigung in Form eines kleinen Abplatzers um fünf Uhr zu erkennen. Rauschen kann durch Reinigung der Bündeloberflächen auf die gleiche Weise wie bei herkömmlichen faseroptischen Steckverbindern mit Linsenpapier und Isopropanol oder mit standardmäßigen faseroptischen Reinigungswerkzeugen entfernt werden. 1483 Zellen wurden mit Proflavin markiert und das blankliegende Faserbündel vorsichtig auf die Probe aufgesetzt.

Die in vitro-Bildgebung wird hier gezeigt, wobei eine 2,5×-GRIN-Linse an der Bündelspitze befestigt wurde, was zu einer Verbesserung der räumlichen Auflösung und einer Verringerung des Sichtfelds führte. Bei der in vivo-Bildgebung wurde ein Faserbündel mit einem Außendurchmesser von 0,5 Millimetern durch eine 21-Gauge-Nadel geführt und in das Brustfettgewebe einer Maus vorgeschoben, wie in diesem Film zu sehen ist; Adipozyten sind deutlich sichtbar, wobei Bewegungen aufgrund des Herzzyklus auftreten. In diesem Beispiel wurde die Bildgebung der Mundschleimhaut bei einem gesunden menschlichen Probanden unter Verwendung eines größeren Faserbündels mit einem Außendurchmesser von 1,5 Millimetern durchgeführt.

In allen Beispielen wurde Pro-Flavin als fluoreszierendes Kontrastmittel für die Kernfärbung verwendet. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein faseroptisches Mikroendoskop für die In-C-Zwei-Fluoreszenz-Bildgebung von Zellen und Geweben entwirft und zusammenbaut.