Optimierte Transfektion Strategie für Expression und elektrophysiologische Ableitung von rekombinantem Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T-Zellen

Die Elektrophysiologie wird häufig verwendet, um die Aktivität rekombinanter spannungsabhängiger Ionenkanäle in kultivierten humanen embryonalen Nierenzellen zu untersuchen. Für eine erfolgreiche Ableitung ist erforderlich, dass die Zellen Kanäle in ausreichender Menge an der Zellmembran exprimieren, um sie nachweisen zu können, und dass die Zellen in geringer genug Zelldichte ausgesät werden, um einzelne Zellen isolieren zu können. Die Durchführung von Zellableitungen wird häufig durch die langen Inkubationszeiten bei 28 Grad Celsius, die für eine solche Expression notwendig sind, erschwert, da dabei typischerweise ein Verlust der Zelladhäsion und Membranstabilität auftritt.

Hier wird eine optimierte Methode für die Zellkultur und Transfektion vorgestellt, die diese Probleme umgeht. Die Zellen werden bei mäßiger Konfluenz transfiziert und anschließend bei 28 Grad Celsius inkubiert, bis eine ausreichende Expression der Ionenkanäle erreicht ist. Die transfizierten Zellen werden dann mit geringer Dichte auf Glasdeckenplättchen ausplattiert und für mehrere Stunden bei 37 Grad Celsius inkubiert, um die Zellanheftung und Membranstabilisierung zu ermöglichen.

Einmal passend platzierte Zellen werden anschließend durch koexprimiertes EGFP und Ganzzell-Patch-Clamp identifiziert. Die Ableitung kann durchgeführt werden, oder die Zellen können erneut bei 28 Grad Celsius inkubiert werden. Um die Oberflächenexpression der Kanäle weiter zu erhöhen, zeigen Ergebnisse von Ableitungsexperimenten an Zellen, die mit spannungsabhängigen Kalziumkanälen wie L CAV1, L CAV2 oder L cav3 transfiziert wurden, dass die Kanäle erfolgreich in die Zellen eingebracht und von diesen exprimiert wurden.

Obwohl in unserem Labor nur repräsentative Ergebnisse für L CAV drei gezeigt werden, haben wir eine Methode entwickelt, um die Expression schwach exprimierender Ionenkanal-Gene für die Patch-Clamp-Aufzeichnung in menschlichen Zelllinien zu verbessern. Der herkömmliche Ansatz besteht darin, die Zellen auf Deckgläsern zu verteilen, mit Plasmid-cDNAs, die die Ionenkanal-Gene enthalten, zu transfectieren und anschließend über mehrere Tage bei 28 Grad Celsius zu inkubieren, um vor der elektrophysiologischen Aufzeichnung eine hocheffiziente Expression der Ionenkanäle zu erreichen. Unser neuer Ansatz verkürzt die erforderliche Inkubationszeit bei 28 Grad Celsius vor der Aufzeichnung erheblich.

Wenn nun die Inkubationszeit bei 28 Grad verringert wird, stellen wir fest, dass die Zellmembranen weitaus stabiler sind und die transfizierten Zellen deutlich besser auf den Deckgläsern haften. Dies erhöht die Anzahl der aufnehmbaren Zellen und macht Experimente signifikant effizienter. Vor der Transfektion eine vollständig konfluente Flasche mit HEK 2 9 3 T-Zellen im Verhältnis 1:4 in eine neue 25 cm²-Flasche aufteilen und die Zellen in einen 37 °C warmen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid stellen.

Lassen Sie die Zellen drei bis vier Stunden anhaften. Untersuchen Sie die Zellen nach vier Stunden mittels differentieller Interferenzkontrastmikroskopie, um die Anheftung zu überprüfen. Beachten Sie, dass die Zellen nicht mehr rund aussehen und sich abflachen. Fortsätze oder Pseudopodien sind sichtbar.

Zellen mit geringerer Konfluenz würden gleich aussehen, aber weiter voneinander entfernt liegen. Sobald die Zellen angeheftet haben, kombinieren Sie die notwendigen Reagenzien, um eine Standard-Calciumphosphat-Transfektion durchzuführen. Bereiten Sie insgesamt 12 Mikrogramm DNA in 600 Mikroliter Transfektionslösung pro Kolben vor.

Hier werden cDNAs verschiedener Ionenkanäle in den P-I-R-E-S-Zwei-EGFP-Plasmid kloniert. Die Transfektion dieses Expressionsvektors in eine Säugerzelllinie führt zur Produktion des verbesserten grün fluoreszierenden Proteins aus derselben mRNA wie dem klonierten Insert, wobei die Translation an einer internen Ribosomen-Einstiegsstelle initiiert wird, die sich unmittelbar downstream der Ionenkanal-Kodiersequenz und upstream der EGFP-Kodiersequenz befindet. Dies ermöglicht die Identifizierung positiv transfizierter Zellen, ohne dass die Proteinfunktion möglicherweise durch die direkte Fusion des EGFP-Proteins mit dem Protein von Interesse beeinträchtigt wird.

Pipettieren Sie die Transfektionslösung tropfenweise über die Zellen, schwenken Sie das Kolben vorsichtig und stellen Sie es über Nacht in den 37 Grad Celsius warmen Inkubator. Überprüfen Sie am nächsten Tag die Transfektionseffizienz, indem Sie die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachten. Positiv transfizierte Zellen sollten im gesamten Zellverband grün erscheinen.

Nachdem die Transfektion verifiziert wurde, pipettieren Sie vorsichtig vier bis fünf Milliliter warmes Medium in den umgekehrten Kolben. Waschen Sie die Zellen, indem Sie den Kolben langsam umdrehen, sodass die Zelloberfläche nach unten zeigt, und schwenken Sie den Kolben, damit die Waschlösung sanft über die Zellen fließt. Entfernen Sie das Medium und wiederholen Sie diesen Waschschritt.

Wiederholen Sie den Schritt noch zweimal. Geben Sie anschließend sechs Milliliter Medium hinzu und inkubieren Sie den Kolben zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Die Expression von Invertebraten-Ionkanälen birgt einige Herausforderungen.

Zunächst sind sie oft von großer Größe und können daher am endoplasmatischen Retikulum lange für die Translation benötigen. Außerdem können sie in einer Säugerzelllinie möglicherweise nicht effizient zur Zellmembran geleitet werden. Schließlich weisen heterologe cDNAs, da verschiedene Arten unterschiedliche Codonnutzungshäufigkeiten aufweisen, möglicherweise hohe Häufigkeiten von Codons auf, die in Säugerzellen wie HEK 2 9 3 T ungewöhnlich sind, um einige dieser Schwierigkeiten zu überwinden.

Nach der zweistündigen Inkubation bei 37 Grad Celsius nach dem Transfektionsansatz die Kolben für zwei bis sechs Tage in einen Inkubator bei 28 Grad Celsius überführen, um die Expressionsphase zu verlängern. Die Inkubationszeit muss empirisch für jeden Typ exprimierter Ionenkanäle bestimmt werden. Da eine längere Inkubation bei 28 Grad Celsius zu Zellablösung und schlechter Membranstabilität führt.

Zusätzliche Zellvorbereitungen sind erforderlich, bevor elektrophysiologische Untersuchungen durchgeführt werden können. Entfernen Sie zunächst das Medium aus den transfizierten Zellen, indem Sie mit einer Pipette ein Milliliter Trypsinlösung bei 37 Grad Celsius in einen umgekehrten Kolben aufsaugen. Bringen Sie den Kolben dann vorsichtig in die Position mit der Zelloberfläche nach unten, damit das Trypsin sanft über die Zellen fließen kann.

Drehen Sie das Kolben erneut um und entfernen Sie den Trypsin. Geben Sie dann 250 Mikroliter warmen Trypsin direkt über die Zellen und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für drei bis fünf Minuten, bis sich die Zellen ablösen. In der Zwischenzeit bringen Sie drei bis acht mit Poly-L-Lysin beschichtete Deckgläser in eine 60 Millimeter große Kulturschale ein und geben fünf Milliliter warmes Kulturmedium hinzu.

Nachdem sich die Zellen gelöst haben, suspendieren Sie sie durch etwa sechsmaliges Auf- und Abpipettieren in vier Milliliter warmem Medium. Danach drücken Sie mit der Spitze der Mikropipette vorsichtig auf die Deckgläser, um sicherzustellen, dass diese auf dem Boden der Petrischale liegen. Anschließend geben Sie 250 bis 500 Mikroliter der resuspendierten Zellen hinzu. Inkubieren Sie die Zellen drei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, damit sie sich an den Deckgläsern anheften können.

Wenn die Zellen zu lange bei 37 Grad belassen werden, kommt es zur Zellteilung und Verdünnung der transfizierten Plasmide. Die transfizierten Zellen sollten mit ausreichend geringer Dichte ausgeplattet werden, sodass sie wie hier gezeigt voneinander isoliert sind. Dies erleichtert die elektrophysiologische Ableitung.

Für Zellen, die Hilfssubuniten benötigen, ist es oft notwendig, die Zellen auf 28 Grad Celsius zu überführen und sie für weitere drei bis vier Tage vor der elektrophysiologischen Ableitung zu inkubieren. Die Ableitung wird bei Zellen durchgeführt, die keine Hilfssubuniten benötigen. Die Ableitung kann unmittelbar nach dieser Inkubation durchgeführt werden.

Die hier verwendete Elektrophysiologie-Ausrüstung umfasst einen Verstärker, motorisierte, doppelte Pipettenmanipulatoren und ein Epi-Fluoreszenzmikroskop sowie Perfusionsysteme. Die Geräte sind auf einem vibrationsgedämpften Tisch montiert und vor störenden elektrischen Feldern abgeschirmt. Elektrische Störungen werden durch einen 40 Zoll hohen Ferrettkäfig vom Typ 2 begrenzt. Elektronische Steuersysteme bestehen aus einem PC, der mit einer Digit Data 1440 und einer Analog-Digital-Wandler-Schnittstelle in Verbindung mit der P-Clamp-10.1-Software ausgestattet ist.

Der Computermonitorverstärker, der motorisierte Manipulator und ein Ventil-Link-Perfusionskontrollsystem sind alle außerhalb des Faradayschen Käfigs montiert. Auf einem freistehenden 19-Zoll-Metallelektrorack sind alle elektrischen Geräte an einen Kupferverteiler geerdet und an einen medizingerechten Isolierungstransformator angeschlossen, der eine Leitungsisolierung, einen konstanten Erdungspunkt und Überspannungsschutz bietet. Bereiten Sie Experimente vor, indem Sie feuerpolierte Mikropipetten mit einem Widerstand von zwei bis fünf Megaohm am Mikropipettenhalter auf der Kopfplatte befestigen.

Die Patch-Pipetten werden mit der intrazellulären Lösung gefüllt, kurz geschüttelt, um Luftblasen zu entfernen, und anschließend am Kopfhalter befestigt. Danach mit einer Pinzette eine Deckglasplatte mit kultivierten Zellen in eine 35-Millimeter-Plastik-Petrischale überführen, die drei Milliliter äußere Ableitungslösung bei Raumtemperatur enthält. Das Volumen der Ableitungslösung muss genau bestimmt werden, wenn Arzneimittelversuche durchgeführt werden, bei denen bekannte Mengen eines Wirkstoffs mit einer Mikropipette in die Schale gegeben werden; stellen Sie die Schale dann auf den Mikroskoptisch.

Füllen Sie dann eine Mikroelektrodenhalter-Halbzelle mit drei molarer Cäsiumchloridlösung. Führen Sie danach die Referenzelektrode in die Halbzelle ein und platzieren Sie die Erdungselektrode mithilfe des Mikromanipulators in das Bad. Senken Sie die Patch-Pipette in die Badelektrolytlösung ab. Visualisieren Sie die Zellen im Fluoreszenzmodus und zentrieren Sie eine isolierte, positiv transfizierte, grün fluoreszierende Zelle in der Mitte des Sichtfeldes.

Befinden Sie sich im Bad-Modus, führen Sie die Patch-Pipette nahe an die Zelle heran. Nullen Sie die auf dem Computerbildschirm beobachtete Rechteckwellenkurve. Justieren Sie die Position der Patch-Pipette so, dass sie gerade die Zelle berührt und die rechteckförmige Stromkurve auf dem Bildschirm zu fluktuieren beginnt.

Sanften Sog mit einer angeschlossenen Spritze anwenden, bis eine Gigaohm-Dichtung gebildet ist. Sobald eine Gigaohm-Dichtung erreicht ist, auf Patch-Modus umschalten. Mit der Spritze einen kurzen Saugimpuls anwenden, um die Zellmembran zu durchbrechen.

Wechseln Sie dann in den Zellmodus und verwenden Sie am Verstärker die Parameter für Ganzzellmessungen. Um den kapazitiven Überschwinger zu kompensieren, ist es notwendig, die Patchelektrode auszugleichen, sodass die intrazelluläre Aufzeichnungslösung in die gepatchte Zelle dialysiert. Geben Sie hier die für dieses Experiment erstellten Spannungs-Klammer-Protokolle ein.

Der Experimentator hat ein Protokoll entworfen, um Ionenströme durch spannungsabhängige Ionenkanäle zu messen, die auftreten, wenn die Spannung über der Zellmembran moduliert wird. In diesem Fall betrachten wir ein IV-Protokoll, das vorschreibt, dass die Software die Zelle bei minus 110 Millivolt hält und dann einen Schritt auf minus 70 Millivolt für 250 Millisekunden ausführt. Danach kehrt sie jedes Mal zur Haltespannung von minus 110 Millivolt zurück, wobei der Schritt jeweils um 10 Millivolt ansteigt, sodass die Schritte nacheinander zu minus 70 Millivolt, minus 60 Millivolt usw. erfolgen, bis der letzte Schritt bei plus 20 Millivolt liegt.

Filtern Sie die aufgezeichneten Ströme bei 10 Kilohertz mithilfe eines Tiefpass-Bessel-Filters am Verstärker und digitalisieren Sie sie mit einer Abtastrate von zwei Kilohertz unter Verwendung der Clamp-X-10.1-Software. Verwenden Sie nur Aufzeichnungen mit minimalem Leckstrom von weniger als 10 %. Zur Analyse wurden HEK 293T-Zellen kultiviert und mit L-Cav-3-Kalziumkanälen, wie hier gezeigt, transfiziert. Eine erfolgreiche Transfektion heterologer Ionenkanal-cDNAs wurde durch die Fluoreszenz angezeigt, die vom P-I-R-E-S-2-eeg-FP-Vektor erzeugt wurde.

Hier zeigen wir einen erfolgreichen Nachweis der Expression eines invertibraten Cav3-Voltages-Calciumkanals. Wenn die Zellen nicht transfiziert werden, können keine Calciumströme ausgelöst werden. Im Gegensatz dazu erzeugen transfizierte Zellen große Ströme, wenn Ganzzell-Spannungsclamp-Protokolle auf die Zellen angewendet werden.

Experimentatoren können je nach Anforderungen verschiedene elektrophysiologische Bedingungen und Datenauswertungsverfahren verwenden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, dass Sie Ihr eigenes Urteilsvermögen hinsichtlich des Zeitpunkts der Experimente einbringen. Da verschiedene Kanäle mit unterschiedlichen Effizienzen in der Zellmembran exprimiert werden, liegt es an Ihnen, die optimale Strategie zu bestimmen, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhöhen und gleichzeitig die Oberflächenexpression der von Ihnen untersuchten Kanäle zu maximieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, hoffen wir, dass Sie ein gutes Verständnis dafür erworben haben, wie man eine humane Zelllinie kultiviert und pflegt sowie wie man heterologe Ionkanal-cDNAs und Untereinheit-cDNAs in diese Zellen transfiziert. Für elektrophysiologische Ableitungen.