Umweltfreundliche Induced vererbbare Veränderungen in Flax

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Methode zur Kultivierung einer induzierbaren Flachssorte unter Bedingungen zu demonstrieren, die vererbbare genomische Variation hervorrufen. Außerdem werden genomische Veränderungen überwacht und das Wachstum der induzierten Pflanzen in nachfolgenden Generationen unter verschiedenen Umweltbedingungen beobachtet. Um dies zu erreichen, wird Flachs unter einer Vielzahl an induzierenden Bedingungen kultiviert.

Anschließend werden Blatt- und Maris-Stängelgewebe zu verschiedenen Zeitpunkten während des Wachstums der Pflanzen unter den unterschiedlichen Umweltbedingungen gesammelt. Danach werden DNA und RNA aus den Gewebeproben isoliert. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, PCR mit den DNA-Proben und Q-R-T-PCR mit der isolierten RNA durchzuführen, um genomische Veränderungen und Veränderungen der Genexpression zu identifizieren, die aus dem Wachstum unter verschiedenen Umweltbedingungen resultieren.

Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die die genomische Antwort auf Wachstumsbedingungen zeigen, mit dem Auftreten des LIS-1-Insertionselements an einer bestimmten Stelle im Genom und expressionsbezogenen Unterschieden, die mit der Präsenz dieses Elements assoziiert sind, sichtbar gemacht durch PCR und Echtzeit-PCR, die mit aus den Geweben behandelter Pflanzen isolierter Nukleinsäure durchgeführt wurden. Hallo, ich bin Chris Cull vom Fachbereich Biologie der Case Western Reserve University. Ich bin Cory Johnson aus dem Cull-Labor.

Und ich bin Tiffany Moss, ebenfalls aus dem Cull-Labor. Und ich bin Marshall Lucas, ein Bachelorstudent im Sommerforschungsprogramm am Cull-Labor.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um genomische Veränderungen und Veränderungen der Genexpression zu untersuchen, die sich aus Variationen der Wachstumsbedingungen ergeben. Beginnen wir also. Um Lein unter induzierenden Bedingungen zu kultivieren, füllen Sie zunächst Töpfe mit einem Durchmesser von fünf Zoll mit Erde und verdichten diese.

Nächste Pflanze, drei Leinsamen pro Topf, eine Viertelzoll tief. Anschließend Erde über die Samen geben für die nicht induzierenden Kontrollbedingungen. Bewässern Sie die Pflanzen mit 100 Milliliter einer zehntelstarken Miracle-Gro-Lösung.

Behandeln Sie die Pflanzen unter hohen Nährstoffbedingungen mit 100 Milliliter voller Stärke. Miracle Grow. Schließlich auftragen.

Nur Leitungswasser zu den nährstoffarmen Pflanzen geben. Die Pflanzen während des Wachstums im Sommer unter natürlicher Beleuchtung kultivieren. Alle Pflanzen zweimal täglich für jeweils fünf Minuten mit einer automatischen Sprühanlage bewässern.

Wenden Sie die Wachstumsbedingungen einmal pro Woche an den Pflanzen an. Sammeln Sie die Blätter wöchentlich in Mari-Stängeln. Für die DNA-Extraktion werden sechs Blätter gesammelt und für die RNA-Extraktion nach der Sammlung werden drei Me-Stängel benötigt. Geben Sie das Pflanzenmaterial in ein Kryo-Röhrchen, gefrieren Sie es schnell in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius, bis sie extrahiert werden.

Die drei Genotypen wachsen je nach Bedingungen mit unterschiedlichen relativen Wachstumsraten. Unter Kontrollbedingungen wächst die inzüchtige Leinsorte Storm bzw. die PL-Linie am besten. Mehrere Linien wurden von diesem Elter ausgeleitet, wobei eine große oder L-Varietät kräftiger wächst als die kleine oder S-Varietät.

Doch unter geringen Nährstoffbedingungen wächst S besser als entweder L oder pl. Und unter hohen Nährstoffbedingungen wächst L besser als pl, das nur geringfügig besser wächst als S. Ein Vergleich zwischen den jeweiligen Linien, die unter den drei unterschiedlichen Behandlungen kultiviert wurden, zeigt, dass PL unter Kontrollbedingungen am besten wächst. L wächst am besten unter hohen Nährstoffbedingungen, und S wächst unter hohen Nährstoffbedingungen und Kontrollbedingungen ähnlich gut.

Diese Daten zeigen, dass die drei Linien anhand ihres Wachstums unter den drei Umgebungen unterschieden werden können. Während PL und L unter bestimmten Umgebungen besser wachsen, wächst S in allen drei Bedingungen etwa gleich. S kann sich verbesserte Nährstoffbedingungen nicht zunutze machen, ist jedoch unter sehr geringen Nährstoffbedingungen besser in der Lage zu wachsen.

Für die DNA-Extraktion Puffer AP1 aus dem Qiagen DNEasy Plant DNA Gewinnungskit zusammen mit sechs Blättern und sterilem Sand in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben und das Gewebe mit einem Mikrostab bis zur Auflösung aller Klumpen homogenisieren. Die Extraktion gemäß den Anweisungen des Kits fortsetzen. Für den Beginn der RNA-Extraktion drei Maisstängel sowie umgebende Blätter aus einer Lagertube (Kryoröhrchen) in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Sterilen Sand zum Röhrchen hinzufügen und das Gewebe mit einem Mikrostab fein mahlen.

Vortexen Sie die Probe 15 Sekunden lang, um die Lyse zu unterstützen, und zentrifugieren Sie sie anschließend eine Minute bei 13.000 U/min, um Sand und jegliche Rückstände zu pelletieren. Geben Sie den SNAT auf die Säule und fahren Sie gemäß den Herstelleranweisungen mit der RNA-Präparation fort. Sobald die RNA aus dem Gewebe extrahiert ist, geben Sie 10 XDNA-Puffer in einem Zehntel des RNA-Proben-Volumens zur Reaktion hinzu.

Und bei 30 Einheiten DNs die Reaktion 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, gefolgt von fünf Minuten bei 70 Grad Celsius. Führen Sie die Reverse Transkription mit dem RNA-zu-CDNA-Kit von Applied Biosystems gemäß Hersteller- und S-Anweisungen durch. Inkubieren Sie die Reaktion eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und anschließend fünf Minuten bei 95 Grad Celsius.

Abschließend werden fünf Mikroliter der cDNA in einem 1,5 %igen AROS-Gel zur Bestimmung der Ausbeute laufen gelassen. Sobald die Lein-cDNA hergestellt wurde, wird sie für die qPCR verwendet. Führen Sie die qPCR mit einem ABI StepOne-System durch.

Führen Sie alle Assays in jeder Durchführung im Dreifachansatz durch und verwenden Sie das Housekeeping-Gen Actin als Kopienzahlkontrolle, um die Reaktionen für die QPCR vorzubereiten. Geben Sie ein Mikroliter des entsprechenden Primerpaares in jedes Reaktionsgefäß. Verdünnen Sie die DNA auf die geeignete Konzentration und geben Sie neun Mikroliter zu jedem Reaktionsgefäß hinzu.

Fügen Sie schließlich 10 Mikroliter der zweifachen Cybergreen-PCR-Mastermix-Lösung zu jedem Röhrchen hinzu. Richten Sie danach das Amplifikationsprogramm gemäß der Amplifikation ein. Berechnen Sie die relativen Expressionsniveaus anhand der Zyklenzahl für die Schwelle, die durch die Standardparameter der Step-One-Software bestimmt und durch Überprüfung der Amplifikationskurven bestätigt wird.

Die PCR-Amplifikation aus der DNA, die aus Blättern an verschiedenen Positionen entlang des Stängels isoliert wurde, zeigt das Auftreten eines einzelnen 5,7 Kilobasen langen DNA-Fragments, das als Insertionssequenz der Linie oder LIS eins bezeichnet wird, wenn die Pflanzen unter induzierenden Bedingungen gezüchtet werden. LIS eins erscheint, wenn PL unter nährstoffarmen, induzierenden Bedingungen gezüchtet wird, und wird schließlich homozygot. Hier wurden Blattproben eins bis sechs in wöchentlichen Abständen isoliert, wobei Probe eins die früheste nach der Aussaat war. Anschließend wurde die DNA aus den Proben extrahiert.

Mittels PCR-Amplifikation lässt sich das Vorhandensein beider Termini von LAS one in allen Proben nachweisen, mit Ausnahme der ersten Probe. Dies entspricht dem Verschwinden der nicht eingefügten Insertionsstelle, wobei bis zum fünften Blatt mittels QPCR kein Hinweis auf deren Existenz mehr vorliegt. Die Ergebnisse zeigen, dass das Vorhandensein von LAS one oder anderer genomischer Veränderungen, die mit der Induktion assoziiert sind, die Expression von Genen in unmittelbarer Nähe von S one beeinflusst.

Die sechs hier gezeigten Gene werden alle unterschiedlich in PL und S exprimiert; vier der Gene weisen eine höhere Expression in pl auf, das LIS nicht besitzt. Umgekehrt zeigen zwei Gene eine höhere Expression in S, das LIS besitzt. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie man induzierbare Flachslinien züchtet. Demnach verändert sich das Genom als Reaktion auf die Wachstumsumgebung sowie die Wachstumseigenschaften der nachfolgenden Generationen.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass die Wachstumsbedingungen repliziert werden müssen, um eine reproduzierbare Induktion von Veränderungen zu gewährleisten. Das war's. Ich weiß, dass viele von Ihnen diesem Phänomen gegenüber skeptisch sind, doch nun können Sie die Beobachtungen selbst reproduzieren.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.