Automatisierte Sholl Analyse digitalisierter neuronale Morphologie bei Multiple Scales

Dieses Video demonstriert ein Verfahren zur Analyse der Morphologie von Dendriten und Axonen, gemeinsam bekannt als Neuriten, unter Verwendung eines halbautomatischen Programms, um lokale Veränderungen zu beobachten. Zunächst wird die Neuron-J-Software verwendet, um 8-Bit-TIFF-Bilder von Neuronen zu verfolgen und die Position von Neuritenabschnitten zu identifizieren. Anschließend dient die Neuron-Studio-Software zur Definition struktureller Informationen über die Verbindungen zwischen Neuriten.

Schließlich wird das Bonfire-MATLAB-Programm ausgeführt, um morphologische Daten aus den Zellen zu extrahieren, einschließlich der Shoal-Analyse sowie der Anzahl der Neuritenverzweigungsstellen und Neuritenenden. Die Ergebnisse zeigen lokale Veränderungen in der Neuritenmorphologie, basierend auf der Durchführung der Shoal-Analyse an Teilbereichen des neuronalen Baums. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der manuellen Shoal-Analyse, liegt darin, dass das Programm halbautomatisiert ist, was die Effizienz der Analyse erheblich steigert und es ermöglicht, die Daten nachzuvollziehen, sodass die Genauigkeit der Analyse überprüft werden kann.

Den Ablauf demonstriert Hirsch AWA, Studierende im Bachelorstudium, die im Sommer im Firestein-Labor arbeitet. Um das Bonfire-Programm zur Analyse der morphologischen Merkmale der Neuriten verwenden zu können, müssen achtbitige TIFF-Bilder einzelner Neuronen nach dem Herunterladen des Bonfire-Programms erhalten werden. Die Programmeinstellungen müssen basierend auf der Bildauflösung der zu analysierenden Bilder angepasst werden. Im Abschnitt „Bonfire-Parameter“ des Bonfire-Programms ersetzen Sie den aktuellen Wert der Variablen „Picks-Konvertierung“ durch den Wert der Bildauflösung Ihrer Bilder.

Um die Daten mit bonfire analysieren zu können, müssen die Dateien in einer bestimmten Struktur organisiert sein, die einen Hauptordner, einen bonfire-Ordner mit den bonfire-MATLAB-M-Dateien sowie Unterordner für die verschiedenen Bedingungen umfasst. Die Bilddateien der Zellen befinden sich innerhalb der Ordner der jeweiligen Bedingungen. Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Bildes für die Nachverfolgung. In diesem Experiment werden ausschließlich die Dendriten nachverfolgt, um Veränderungen in der dendritischen Morphologie zu analysieren. Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Bildes für die Nachverfolgung.

Öffnen Sie das Bild, indem Sie die Schaltfläche „Öffnen“ in der Neuron-J-Symbolleiste auswählen, und wählen Sie das Bild aus, das Sie verfolgen möchten. Ändern Sie nun die Größe des Bildes, indem Sie die Schaltfläche „Maximieren“ auswählen, um Helligkeit und Kontrast des Bildes anzupassen, sodass Sie alle Neuriten visualisieren können. Wählen Sie das Bild in der Neuron-J-Symbolleiste aus und klicken Sie dann auf „Helligkeit/Kontrast anpassen“. Um mit der Verfolgung zu beginnen, wählen Sie die Schaltfläche „Spuren hinzufügen“ in der Neuron-J-Symbolleiste und zeichnen Sie entlang des Umfangs des Zellkörpers.

Wählen Sie dann die Schaltfläche „Label-Tracings“ in der Neuron-J-Symbolleiste aus, wählen Sie N eins aus dem Dropdown-Menü „Tracing-ID“ und wählen Sie im Fenster „Neuron-J-Attribute“ den Typ null sechs aus, gefolgt von „OK“. Um mit dem Nachzeichnen der Neurite zu beginnen, klicken Sie auf die Schaltfläche „Spuren hinzufügen“ in der Neuron-J-Symbolleiste und fügen Sie entlang jedes interessierenden Neuriten-Astes eine Spur hinzu. Es ist am besten, wenn die von Ihnen gezeichneteten Segmente an jedem Verzweigungspunkt enden, wobei jede Tochterverzweigung an diesem Punkt als neue Spur beginnt.

Wählen Sie die Schaltfläche „Tracings speichern“ in der Neuron-J-Symbolleiste aus und speichern Sie die soeben erstellte Tracing-Datei in demselben Ordner wie die ursprüngliche Bilddatei. Exportieren Sie anschließend die Trace-Dateien und die Trace-Kennzeichnungsdateien aus Neuron J. Wählen Sie hierzu die Schaltfläche „Trace exportieren“ in der Neuron-J-Symbolleiste. Wählen Sie nun im Exportdialogfeld von Neuron J die Option „Tabulatorgetrennte Textdateien, separate Datei für jedes Tracing“ und klicken Sie auf „OK“. Ermöglichen Sie Neuron J, die Dateinamen und den Speicherort selbst zu wählen.

Wählen Sie die Schaltfläche „Measure Tracings“ in der Neuron-J-Symbolleiste aus, anschließend die Option „Display Tracings Measurements“ im Neuron-J-Messfenster und führen Sie dann im Neuron-J-Tracings-Fenster „Select File“ aus. Danach wählen Sie „Save As“ und speichern die Datei. Der Dateiname muss exakt dem Namen der ursprünglichen Bilddatei entsprechen, gefolgt von einem Unterstrich und „info“, und sollte keine dreibuchstabige Dateierweiterung enthalten. Stellen Sie sicher, dass Ihr Computer nicht automatisch eine XLS-Dateierweiterung hinzufügt.

Falls ja, muss die Dateierweiterung manuell gelöscht werden. Ordnen Sie zuerst die Ordner mithilfe von „bonfire load“ neu, indem Sie Matlab öffnen und im Befehlsfenster oben rechts auf die Schaltfläche mit den drei Punkten klicken. Wählen Sie im Fenster „Ordner durchsuchen“ den „bonfire“-Ordner in Ihrem Hauptordner aus, geben Sie „bonfire load“ in das Befehlsfenster ein und drücken Sie die Eingabetaste.

Wählen Sie den Bedingungsordner aus, den Sie im Fenster „Ordner durchsuchen“ analysieren möchten, und bestätigen Sie mit „OK“. Dadurch wird die Ordnerstruktur neu geordnet, indem Zellunterordner erstellt werden, die alle Daten für jede einzelne Zelle enthalten. Um Dateinamen_unterstrich_Premium_swc-Dateien zu erstellen, geben Sie im Befehlsfenster „bonfire_unterstrich_NDF_zwei_s_WC“ ein und drücken die Eingabetaste.

Wählen Sie denselben Bedingungsordner aus, der gerade mit der Bonfire-Last neu organisiert wurde, im Fenster „Ordner durchsuchen“ und klicken Sie auf „OK“. Dadurch wird in jedem Zellordner eine WC-Datei für die gewählte Bedingung erstellt. Jeder Zellordner enthält fünf Dateien.

Das ursprüngliche TIF-Bild, die NDF-Datei, die Unterstrich-Info, die Spurenkennungsdatei, eine TXT-Datei und eine SWC-Datei. Bevor Sie Neuron Studio verwenden, empfehlen wir Ihnen, sich mit den Funktionen und Tastenkürzeln des Programms vertraut zu machen. Sie verfügen über ein hervorragendes Online-Benutzerhandbuch, und die Kenntnis der Tastaturkürzel wird Ihnen viel Zeit ersparen.

Öffnen Sie zunächst das Neuron Studio-Programm und wählen Sie in der Symbolleiste von Neuron Studio „Datei öffnen“. Suchen Sie das TIF-Bild des Neurons, das Sie bearbeiten möchten, und öffnen Sie es. Wählen Sie „Einstellungen ausführen“ und geben Sie jeweils eine Eins in die drei Felder ein.

Wählen Sie im Fenster „Voxelgröße“ den Dateiimport s wc aus. Wählen Sie die passende s WC-Datei aus, die der Datei entspricht, mit der Sie arbeiten möchten. Die Bilddatei wird nun mit dem Spurbild überlagert.

Der Zellkörper sollte mit einem roten Kreis überlagert werden, um die Neuriten zu verbinden. Verwenden Sie das Neuriten-Werkzeug, um Knotenpunkte zu verbinden, sodass jeder durch gelbe Knoten dargestellte Verzweigungspunkt nur zwei Äste erzeugen kann. Alle Spuren müssen kontinuierlich mit dem Soma verbunden sein.

Um nun Daten aus Neuron Studio zu exportieren, wählen Sie Datei, speichern Sie die Neuriten und speichern Sie unter dem Standardnamen, um auf Fehler in den SWC-Dateien zu prüfen, geben Sie im Befehlsfenster „bonfire trace“ ein. Wechseln Sie zum Befehlsfenster und drücken Sie die Eingabetaste. Wählen Sie den Bedingungsordner aus, der die gerade verarbeiteten Daten enthält, im Fenster „Ordner durchsuchen“ und bestätigen Sie mit OK. Falls Fehler in einem der Bilder im Ordner auftreten, werden diese angezeigt.

Das Programm gibt Bilder aus, die anzeigen, an welcher Stelle der Fehler lokalisiert ist, um morphologische Daten aus den Punkt-S-WC-Dateien zu extrahieren. Geben Sie „bonfire“ in das Befehlsfenster ein und drücken Sie die Eingabetaste. Wählen Sie im Fenster „Ordner durchsuchen“ den Bedingungsordner aus, den Sie analysieren möchten, und bestätigen Sie jeden der interessierenden Neuronen mit „OK“.

Die Bonfire-Analyse erzeugt eine Grafik der neuronalen Morphologie zusammen mit den Schulterringen, die bei der Analyse verwendet wurden. Zusätzlich erzeugt der Befehl „bonfire“ die MAT-Datei, die alle morphologischen Informationen enthält, die aus der Analyse gewonnen wurden. Um die vorläufigen Grafiken der Daten anzuzeigen, geben Sie im MATLAB-Befehlsfenster „bonfire results“ ein, wählen Sie im Fenster „Browse for Folder“ den Ordner der entsprechenden Bedingung aus und klicken Sie auf „Okay“.

Das Fenster „Ordner durchsuchen“ schließt sich vorübergehend und öffnet sich erneut, wodurch zusätzliche Bedingungen ausgewählt werden können. Sobald die Bedingungen ausgewählt wurden, wählen Sie „Abbrechen“, um den Auswahlvorgang zu beenden. Das Bonfire-Ergebnis liefert Zusammenfassungsdiagramme, die die Daten aus den ausgewählten Bedingungsordnern enthalten, um die morphologischen Daten im Excel-Format nach Bonfire zu exportieren, sowie den Export in das MATLAB-Befehlsfenster.

Wählen Sie im Fenster „Ordner durchsuchen“ den Bedingungsordner aus, der die zu exportierenden Daten enthält, und bestätigen Sie Ihre Auswahl. Okay, der Bonfire-Export erstellt Excel-Dateien mit den morphologischen Daten und speichert sie im zuvor ausgewählten Bedingungsordner. Im Folgenden zeigen wir Ihnen ein Beispiel für die Daten, die das Bonfire-Programm für einen Datensatz mit zwei Bedingungen generiert.

Dies sind Beispielbilder der invertierten Darstellung beider Bedingungen. Aus diesen Bildern ist ersichtlich, dass Bedingung eins mehr Dendriten enthält als Bedingung zwei. Dieses Phänomen kann ebenfalls in einer Vielzahl von Grafiken beobachtet werden, die vom Bonfire-Programm generiert werden.

Da das Bonfire-Programm seine Analyse auf Teilbereichen der Dendriten durchführt, können die vermehrten Dendriten in Bedingung eins leicht identifiziert werden. Die Darstellung der Shoal-Kurve des gesamten dendritischen Baums zeigt, dass es für die Neuronen der Bedingung eins mehr dendritische Fortsätze im distalen Bereich zum Zellkörper gibt. Die Darstellung der durchschnittlichen Anzahl von Verzweigungspunkten und Endpunkten pro Zelle zeigt, dass Bedingung eins sowohl mehr Verzweigungspunkte als auch mehr Endpunkte aufweist als Bedingung zwei. Die durchschnittliche Anzahl von Fortsätzen pro Zelle ist dargestellt für primäre, sekundäre, tertiäre oder höhere Ordnungen von Dendriten. Für Bedingung eins gibt es mehr tertiäre und höhere Ordnungen von Dendriten. Die Darstellung der durchschnittlichen Anzahl von Fortsätzen pro Zelle für Wurzel-, Intermediate- und Terminaldendriten zeigt, dass Bedingung eins mehr intermediate oder terminale Fortsätze als Bedingung zwei aufweist.

Hier werden die segmentidentitätsspezifischen Schwarmanalyse-Kurven gezeigt, bei denen die Segmente als primäre, sekundäre oder tertiäre bzw. höhere Segmente gruppiert sind. Bei Neuronen der Bedingung eins tritt die Zunahme tertiärer Dendriten distal zum Zellkörper auf. Es werden die segmentidentitätsspezifischen Schwarmanalyse-Kurven dargestellt, bei denen die Segmente als Wurzelsegmente, Zwischensegmente oder Endsegmente gruppiert sind.

Der Anstieg sowohl der intermediären als auch der terminalen Dendriten unter Bedingung eins erfolgt distal zum Zellkörper. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Schwarmanalyse mithilfe des Bonfire-Programms durchführt, um lokale Veränderungen in der Neuroanatomie zu beobachten.