Alphavirus transduzierenden System: Werkzeuge für die Visualisierung Infektion in Mosquito Vektoren

Alphaviren sind mückenübertragene RNA-Viren, die empfängliche Mückenzellen persistent infizieren und dabei eine minimale zytopathische Wirkung hervorrufen. Dieses Protokoll zeigt die Anwendung infektiöser Alphavirus-Transduktionssysteme, die fluoreszierende Reporter exprimieren, um die Infektion von Vektoren und die Virusübertragung nachzuweisen. Füttern Sie zunächst weibliche Mücken mit einer Blutmahlzeit, die das gewünschte Alphavirus enthält, bestimmen Sie anschließend die Infektionsrate der Mücken und selektieren Sie ausschließlich Mücken, die das Markergen exprimieren.

Anschließend sammeln Sie Speichel von den infizierten Mücken und weisen die Übertragbarkeit nach, indem Sie kultivierte Mücken-Zellen mit dem gesammelten Speichel infizieren. Ergebnisse werden mittels epifluoreszenzmikroskopischer Untersuchung erhalten. Visualisieren Sie einen Bericht über ein Protein wie GFP und verfolgen Sie so die Vektorinfektion und Virusübertragung durch Aedes- oder Anopheles-Arten von Mücken.

Alphavirus-Expressionssysteme oder ATS können verwendet werden, um die Genexpression und Vektor-Mücken sowohl für Arbovirus-Studien als auch vor komplexeren Mückenmanipulationen wie der Mücken-Transgenese schnell zu bewerten. Die Demonstration dieser Verfahren erfolgt durch Dr. Irma Sanchez Vargas, Dr. Eric Mossel und Aaron Phillips aus dem Labor von Dr. Ken Olson. Um ein TS-Virus in BHK-21-Zellen herzustellen, verwenden Sie ein Symbis-rekombinantes Virus, das nach der In-vitro-Transkription den GFP-Reporter exprahiert, und elektroporieren Sie die genomische RNA des Alphavirus-Transduktionssystems in BHK-21-Zellen.

Anschießend das Virus vor der Infektion retten und amplifizieren. Mücken durch Nahrungsentzug für eine effiziente Blutmahlzeit aus einem künstlichen Fütterungsgerät vorbereiten. Zucker 24 Stunden und Wasser 12 Stunden vor der Fütterung entziehen.

Gemischtes, kommerziell bezogenes defibrilliertes oder zitriertes Tierblut mit der hergestellten, aus Zellkultur stammenden TS-Virus-Suspension zur effizienten Mitteldarminfektion der Mücken. Formulieren Sie eine Virus-Titer von 10 hoch 7 Plaque-bildenden Einheiten pro Milliliter für die Blutmahlzeit, um die Mücken zum vollständigen Saugen anzuregen. Geben Sie TP in einer Endkonzentration von 0,02 molaren hinzu.

Platzieren Sie eine poröse Darmmembran über der Öffnung des wassergekühlten Glasfutterspenders. Richten Sie danach die Spender mit zirkulierendem Wasser von 37 Grad Celsius ein. Pipettieren Sie anschließend die Nahrung in die Kammer und stellen Sie die Spender sicher auf dem Karton ab.

Nachdem die Mücken 10 bis 30 Minuten lang gefüttert wurden, kühlanästhesieren Sie sie, um die blutgefüllten Exemplare zu sortieren, damit die Replikation und Ausbreitung eines TS-Virus in den ausgewählten Mücken erfolgen kann. Inkubieren Sie sie bei 28 Grad Celsius und 75 % relativer Luftfeuchtigkeit für acht bis 10 Tage. Um die Mücken zu immobilisieren.

Stellen Sie die Pappkartonage für etwa 15 Minuten bei vier Grad Celsius. Überführen Sie anschließend fünf bis 10 Mücken auf einen Kühltisch, der für die Verwendung am Fluoreszenzmikroskop angepasst ist. Untersuchen und sortieren Sie die Mücken je nach Vorhandensein oder Fehlen von Fluoreszenz.

Die ausgewählten Mücken können je nach Bedarf in den Pappbehälter zurückgebracht werden. Bestimmen Sie an diesem Punkt die Infektionsrate unter Verwendung der Fluoreszenzintensität als Proxy. Zuletzt sezieren Sie Gewebe wie Mitteldarm, Speicheldrüsen und Fettkörper und überwachen diese auf Fluoreszenz.

Diese Organe und Gewebe können bei Bedarf zu einem früheren Zeitpunkt disseziert werden. Entziehen Sie den Mücken 24 Stunden vor der Fütterung die Zuckerquelle. Bereiten Sie ein 50-Mikroliter-Kapillarrohr vor, das erhitzt, gezogen und abgeschnitten wurde, und geben Sie drei bis fünf Mikroliter Cargill hinein.

Typ-B-Immersionöl verwenden, um sicherzustellen, dass die Mücken nicht entkommen. Entfernen Sie ihre Beine und Flügel. Stecken Sie nun den Rüssel in das Röhrchen.

Überwachen Sie sorgfältig die Speicheltropfen, die aus dem Rüssel in das Immersionsöl austreten. Falls erforderlich, geben Sie nach 60 bis 90 Minuten einen Tropfen 1 % Pilocarpin auf den Thorax der Mücke, um die Speichelabsonderung zu verstärken; anschließend entfernen Sie die Mücken und lagern sie für eine spätere Virusisolation. Um nun die Lösung aus dem Kapillarrohr zu gewinnen, pressen Sie die Speichel-Öl-Mischung in ein Reagenzgefäß, das 500 Mikroliter sterilem 20 % FBS-PBS enthält.

Filtrieren Sie das Inokulum durch einen 0,2-Mikron-Spritzenfilter und verwenden Sie dieses anschließend zur Infektion kultivierter Zellen in Moskitozellen. Die Infektionswirksamkeit des fünf-prime-DS-MRE-16-GFP-Virus wird anhand der Expression von GFP bewertet. Im Zeitverlauf wurden diese Zellen mit dem Virus bei einer Multiplizität der Infektion von 0,01 infiziert.

Ein Epi-Fluoreszenzmikroskop ermöglicht die Ganzkörperansicht von GFP in der infizierten Mücke sowie in den verschiedenen Körperteilen hier 10 Tage nach der Infektion. Die organspezifische Expression von GFP weist auf eine disseminierte Infektion hin. Mittelmägen weisen normalerweise kurz nach der Aufnahme einer virushaltigen Blutmahlzeit deutliche fokale Infektionen auf, die sich zu einem späteren Zeitpunkt nach der Infektion im gesamten hinteren Mitteldarm ausbreiten.

Diese Ereignisse werden durch die GFP- und DS-RED-Reporter angezeigt. Der Transmissionsassay zeigt, dass das 5'-DS-MRE-16-GFP-Virus während der gesamten extrinsischen Inkubationszeit stabil GFP exprimiert. Bei der hier gezeigten Mücke werden GFP und Mückenspeichel bereits acht Tage nach der Infektion nachgewiesen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein A-TS-Virus oral an eine Mücke überträgt, wie man eine Virusinfektion bei einer Mücke visuell beurteilt und wie man die Virusübertragung durch die Mücke bewertet.