Mitochondriale Isolation von der Skelettmuskulatur
30. März 2011
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Atmung von Mitochondrien aus Skelettmuskulatur isoliert zu studieren. Diese Methode wurde von Scorrano angepasst Et al. (2007). Die Mitochondrien isoliert Verfahren erfordert etwa 2 Stunden. Die mitochondriale Atmung kann in ca. 1 Stunde abgeschlossen sein.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Mitochondrien zu isolieren und die mitochondriale Atmung durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst Skelettmuskel von spray dly-Ratten isoliert wird. Anschließend wird das Muskelgewebe homogenisiert und die Mitochondrien durch Zentrifugation abgetrennt.
Die Proteinkonzentration wird anschließend mithilfe des Bradford-Assays bestimmt. Schließlich wird die mitochondriale Atmung mittels Polygraphie gemessen. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die den Sauerstoffverbrauch in den verschiedenen Zuständen der mitochondrialen Atmung zeigen.
Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Skelettmuskulatur beantworten, beispielsweise die Wirkung verschiedener Interventionen auf die mitochondriale Funktion. Obwohl diese Methode Einblicke in den Stoffwechsel der Skelettmuskulatur ermöglicht, kann sie auch auf andere Organe wie Leber, Gehirn, Niere oder nahezu jedes Gewebe angewendet werden, bevor das Verfahren beginnt. Um die Skelettmuskulatur zu isolieren, bereiten Sie die folgenden Lösungen vor: P-B-S-P-B-S mit 10 Millimolar EDTA, achtfach Mitochondrien-Puffer, Isolationspuffer eins oder IB eins, Isolationspuffer zwei oder IB zwei sowie Versuchspuffer oder eb.
Siehe den beigefügten schriftlichen Protokollabschnitt für Anweisungen. Als Nächstes schalten Sie die Zentrifuge ein und stellen sie auf vier Grad Celsius. Schalten Sie ein Wasserbad ein und stellen Sie es auf 37 Grad Celsius.
In einem geeigneten Behälter drei 10-Milliliter-Bechergläser, einen Potter-Elvehjem-Homogenisator, Gewebemörser, kleine chirurgische Scheren und 10 Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis legen. Alles muss während des gesamten Experiments eiskalt gehalten werden. IB eins und IB zwei auf Eis legen und EB in ein warmes Wasserbad stellen.
Dann geben Sie die folgenden Lösungen zu den drei Bechern auf Eis: Becher eins, 10 Milliliter PBS; Becher zwei, 10 Milliliter P-B-S-E-D-T-A; Becher drei, drei Milliliter ib. Euthanasieren Sie eine Ratte gemäß den von Ihrem lokalen institutionellen Tierversuchsausschuss genehmigten Verfahren.
Isolieren Sie anschließend schnell 250 bis 500 Milligramm Skelettmuskel mit einer Pinzette und einer Mayo-Klinik-Schere. Spülen Sie ihn in Becher eins, überführen Sie ihn dann in Becher zwei, um den Muskel zu homogenisieren. Überführen Sie ihn zuerst in Becher drei und zerkleinern Sie ihn schließlich mit der Schere.
Überführen Sie die Lösung in den Potter-Elvehjem-Homogenisator und homogenisieren Sie den Muskel mithilfe eines motorisierten Stößels zehnmal, wobei das Gefäß stets auf Eis gehalten wird. Anschließend überführen Sie das Homogenat in vorab gekühlte 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren 10 Minuten bei 700 × g und 4 °C. Überführen Sie das überstehende S-Überstand in ein neues vorab gekühltes Mikrozentrifugenröhrchen und verwerfen Sie den Pellet.
Das S-Supernatant bei 10.500 Gs für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren, das SNAT in ein neues vorbefülltes Mikrozentrifugenröhrchen überführen und mit SN eins und Muskeltyp Reese beschriften. Den Pellet in 500 Mikrolitern IB zwei suspendieren, anschließend bei 10.500 Gs für 10 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Das Supernatant in ein neues vorbefülltes Mikrozentrifugenröhrchen überführen und mit SN zwei und Muskeltyp beschriften.
Suspendieren Sie das endgültige mitochondriale Pellet in 100 Mikroliter IB zwei. Zentrifugieren Sie es kurz in einer Mini-Zentrifuge. Falls ein Pellet vorhanden ist, überführen Sie das Überstand in ein neues vorbefülltes Mikrozentrifugenröhrchen und entsorgen Sie das Pellet. Die Kalibrierung der Sauerstoffelektrode ist ein entscheidender Schritt in diesem Protokoll und muss täglich durchgeführt werden.
Die Kalibrierung der Elektrode kann während der mitochondrialen Isolierung durchgeführt werden. Zunächst 100 Milliliter destilliertes Wasser in einen 250-Milliliter-Kolben geben und 20 Minuten lang kräftig rühren. Um das Wasser mit atmosphärischem Gas zu equilibrieren, bedecken Sie die GRAT-Elektrode mit einigen Tropfen 50%igem Kaliumchlorid.
Als Nächstes ein kleines Stück blaues Rizla-Filterpapier auf die Elektrode legen. Dann ein Stück PTFE-Membran darauf.
Bringen Sie den inneren Ring mit Hilfe des Ringapplikators auf und setzen Sie anschließend den äußeren Ring in die Elektrodennut ein. Schließen Sie die Elektroden an und montieren Sie die größere Kunststoffringbasis, die Mitochondrienkammer und die Wasserschläuche. Schalten Sie die GRAT-Boxen ein und starten Sie die GRAS-Software.
Geben Sie das equilibrierte Wasser in die mitochondriale Kammer. Fügen Sie dann einen Rührstab hinzu, um den Rührstab einzuschalten. Klicken Sie auf Hardware.
Dann rühren Sie mit einer Geschwindigkeit. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf 60 ein und klicken Sie auf. Beginnen Sie anschließend ein neues Experiment.
Klicken Sie auf Kalibrieren und anschließend auf Flüssigphasenkalibrierung. Ändern Sie bei Box eins die Temperatur auf 37 Grad Celsius und klicken Sie zweimal auf OK. Wenn „Überschreiben“ zu „OK“ wechselt, klicken Sie darauf und öffnen Sie den Stickstoffgasbehälter.
Bringen Sie die mit dem Stickstofftank verbundene Spitze in die Kammer ein und stellen Sie den Sauerstoffgehalt auf null ein. Klicken Sie auf „Okay“, wenn der Überschreibungsmodus beendet ist. Aspirieren Sie das Wasser und geben Sie 500 µL EB in die mitochondrialen Kammern.
Verschließen Sie die Kammer mit einem Kolben. Wenn mehrere Boxen verwendet werden, wiederholen Sie den Vorgang ab dem Kalibrierschritt für jede Box. Starten Sie ein neues Experiment und lassen Sie es etwa eine Minute lang laufen.
Um das Signal zu stabilisieren, geben Sie das notwendige Volumen der Mitochondrien-Suspension hinzu, um in jeder Kammer 150 Mikrogramm zu erreichen. Markieren Sie den Vorgang und lassen Sie es eine Minute laufen. Fügen Sie dann 10 Mikroliter warme 250 Millimolar Glutamat, 125 Millimolar Malat hinzu, um eine Endkonzentration von 5 Millimolar Glutamat, 2,5 Millimolar Malat zu erreichen, markieren Sie diesen Schritt und lassen Sie es eine Minute lang laufen.
Dies wird als Zustand zwei definiert. Fügen Sie anschließend 7,5 µL einer 10 mM aDP-Lösung hinzu, um eine Endkonzentration von 150 µM zu erreichen. Markieren Sie dann und lassen Sie es 30 Sekunden laufen.
Dies wird als Zustand drei definiert. Geben Sie weitere 7,5 µL 10 mmolarer DP-Markierung hinzu und lassen Sie die Reaktion 1,5 Minuten laufen. Fügen Sie 0,5 µL kalten 10 mmolaren Oligomycins hinzu, um eine Endkonzentration von einem µmolaren Markierung zu erreichen, und lassen Sie die Reaktion drei Minuten lang laufen.
Dies wird als Zustand vier definiert. Geben Sie einen Mikroliter kaltes, 0,1 Millimolar FCCP hinzu, um eine Endkonzentration von 0,2 Mikromolar zu erreichen, und lassen Sie RUM drei Minuten lang inkubieren. Dies wird als Zustand fünf definiert.
Wenn Sie fertig sind, beenden und speichern Sie das Experiment. Erfassen Sie die Atmungsraten mithilfe der Raft-Software. Geben Sie den Normalisierungsfaktor ein.
Wenn 150 Mikrogramm mitochondriales Protein hinzugefügt werden, beträgt der Normalisierungsfaktor 0,15. Berechnen Sie die normalisierten Atmungsaktivitäten für die verschiedenen Atmungszustände. Berechnen Sie das Atmungskontrollverhältnis (Respiratory Control Ratio, RCR), indem Sie Zustand drei durch Zustand vier dividieren.
Diese Abbildung zeigt eine repräsentative Aufzeichnung des Sauerstoffverbrauchs durch Mitochondrien der Skelettmuskulatur. Nachdem das Elektroden-Signal stabilisiert ist, wird die Mitochondrienprobe in die GRAT-Kammer gegeben. Der Zustand zwei der Atmung beginnt mit der Zugabe von Glutamat und Malat.
Die Zugabe von A DP erhöht den Sauerstoffverbrauch. Definition von Zustand drei. Die Atmung erfolgt, während A TP-Synthase durch die Zugabe von Oligomycin blockiert ist, um die Atmung im Zustand vier zu erhalten.
Schließlich wird FCCP hinzugefügt, um die mitochondriale Atmung zu entkoppeln. Dieses Diagramm zeigt repräsentative Sauerstoffverbrauchsraten für die Zustände 2, 3, 4 und 5. Für jedes Experiment wird das Atmungs-Kontroll-Verhältnis (Respiratory Control Ratio, RCR) berechnet.
Ein RCR-Wert über vier gilt als Hinweis auf eine leistungsfähige mitochondriale Präparation. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, mitochondriale Proben stets auf Eis zu halten. Nach Abschluss dieses Verfahrens.
Andere Methoden wie Western Blots können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen hinsichtlich des Gehalts an mitochondrialen Proteinen zu beantworten. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Mitochondrien aus Skelettmuskel isoliert sowie die mitochondriale Atmung untersucht.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Isolierung von Mitochondrien aus Skelettmuskulatur und zur Messung ihrer Atmung. Die Methode ermöglicht die Beurteilung der mitochondrialen Funktion mittels Analyse des Sauerstoffverbrauchs.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Stoffwechsel
Hintergrund
- Die Mitochondrien spielen eine entscheidende Rolle bei der Energieproduktion.
- Das Verständnis der mitochondrialen Atmung ist entscheidend für die Untersuchung von Stoffwechselerkrankungen.
- Dieses Protokoll basiert auf etablierten Methoden.
- Die Isolierung von Mitochondrien ist entscheidend für die genaue Messung ihrer Funktion.
Zweck der Studie
- Isolierung von Mitochondrien aus Skelettmuskelgewebe.
- Messung der mitochondriale Atmungsrate.
- Analyse des Sauerstoffverbrauchs in verschiedenen Zuständen der mitochondrialen Atmung.
Verwendete Methoden
- Isolierung von Skelettmuskelgewebe von Sprühtrocknungs-Ratten.
- Homogenisierung des Muskelgewebes.
- Zentrifugation zur Isolierung von Mitochondrien.
- Bestimmung der Proteinkonzentration mittels Bradford-Assay.
- Messung der mitochondrialen Atmung mittels Polygraphie.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Isolierung von Mitochondrien aus Skelettmuskel.
- Quantitative Beurteilung der mitochondrialen Atmung.
- Die Ergebnisse weisen auf unterschiedlichen Sauerstoffverbrauch in verschiedenen Atmungszuständen hin.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll ermöglicht die effektive Isolierung von Mitochondrien für Atmungsstudien.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der mitochondrialen Funktion in Stoffwechselprozessen bei.
- Diese Methode kann auf weiterführende Untersuchungen des Muskelstoffwechsels angewendet werden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Isolierung funktioneller Mitochondrien aus Skelettmuskelgewebe ermöglicht die mechanistische Absicherung metabolischer Zielstrukturen im präklinischen Screening. Quantitative Atmungsparameter liefern eine vorhersagbare Sicherheit für die Validierung von Zielstrukturen und die Untersuchung von Signalwegen. Diese Methode unterstützt frühe Go/No-Go-Entscheidungen, indem sie vor dem Wirkstoffscreening Schwellenwerte für die mitochondriale Vitalität festlegt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem die mitochondriale Funktion mit dem Stoffwechsel der Skelettmuskulatur und der Energiehomöostase verknüpft wird.
- Operationaler Wert: Ermöglicht die biologische Risikominimierung durch standardisierte Isolierung lebensfähiger Mitochondrien mit einem RCR ≥4 als funktionellem Referenzwert.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung durch Quantifizierung der Atmungs-Kontrollraten, die mitochondriale Integrität und Kopplungseffizienz widerspiegeln.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte mitochondriale Systeme für nachgeschaltete biochemische und funktionelle Assays vor, einschließlich Enzymaktivität und Proteomik.
- Operativer Wert: Gewährleistet die Standardisierung von Assays durch tägliche Kalibrierung der Sauerstoffelektrode und konsistente Protein-Normalisierung mittels Bradford-Assay.
- Skalierbarkeitswert: Ermöglicht die zuverlässige Evaluierung von Verbindungen durch reproduzierbare Messungen der Atmung im Zustand 2–5 unter kontrollierten Bedingungen mit Substraten und Inhibitoren.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erhält die Krankheitsrelevanz, indem die mitochondriale Atmung im Skelettmuskel untersucht wird, einem Schlüsselgewebe bei Stoffwechselerkrankungen.
- Operationaler Wert: Schafft eine translationale Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung mittels quantitativer Sauerstoffverbrauchsmessung über verschiedene Atmungszustände hinweg.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt Entscheidungen durch die Messung der entkoppelten (Zustand 5) und ATP-gekoppelten (Zustand 3) Atmung zur Beurteilung der bioenergetischen Gesundheit.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung bis zur Leitsubstanzidentifizierung ein und unterstützt mitochondriale Zielprogramme bei Stoffwechselerkrankungen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung durch die Isolierung von Mitochondrien, um die an der ATP-Synthese und metabolischen Signalübertragung beteiligten Signalwege zu klären.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays durch reproduzierbare Atmungsmessungen, die den Vergleich der Wirkstoffeffekte auf den Sauerstoffverbrauch ermöglichen.
- Analytik: Erzeugt quantitative Messgrößen (Atmungszustände 2–5, RCR), die Teams dabei helfen, Bedingungen zu vergleichen und die mitochondriale Funktion zu bewerten.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem funktionelle mitochondriale Daten bereitgestellt werden, die für Modelle des Muskelstoffwechsels und des Energieverbrauchs relevant sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Isolierung und Atmungsmessung, die auf verschiedene Skelettmuskeltypen anwendbar und an andere Gewebe anpassbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit hinsichtlich der Mitochondrien-Vitalität, Verringerung mechanistischer Unschärfen in Studien zum Energiestoffwechsel.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Methoden zur Isolierung von Mitochondrien und zur Messung der Atmung.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen, Kapital-Effizienz und geringeres biologisches Risiko in fortgeschrittenen Phasen bei Stoffwechselzielprogrammen.
- Portfolio-Implikationen: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Weiterentwicklungsentscheidungen basierend auf Atmungs-Kontrollraten und substratspezifischen Atmungsprofilen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in Techniken zur Isolierung von Mitochondrien, Zentrifugation und Messung der Atmung.
- Benötigt spezielle Geräte wie Homogenisatoren, bei 4 °C gehaltene Zentrifugen, Wasserbäder bei 37 °C und polarographische Sauerstoffelektrodensysteme.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise über mehrere Arbeitsgruppen hinweg voraus, insbesondere bei der Pufferherstellung, täglichen Kalibrierung der Elektroden und streng kalten Probenaufbereitung auf Eis.
- Zu berücksichtigende Anpassungen sind die Variation der Muskelmenge (250–500 mg) und der mitochondrialen Proteinzugabe (150 µg) je nach Typ des Skelettmuskels.
- Praktische Einschränkungen bestehen in der Notwendigkeit frischer Reagenzien, eines kurzen Zeitfensters für funktionelle Untersuchungen (~1 Stunde nach Isolierung) und der täglichen Kalibrierung der Sauerstoffelektroden.
