Quantifizierung von dsDNA mit dem Hitachi F-7000 Fluoreszenz-Spektralphotometer und PicoGreen Dye

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Fähigkeit des fluoreszierenden Spektrophotometers F 7,000 mit Mikroplattenleser zur Quantifizierung doppelsträngiger DNA unter Verwendung des Pico-Green-Farbstoffs zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Proben und Reagenzien vorbereitet werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht in der Einrichtung des Instruments.

Der dritte Schritt des Verfahrens ist das Beladen der Proben in den Mikroplattenreader. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Durchführung der Messung von Standards und Proben. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die eine lineare Kalibrierkurve zeigen, die für die Quantifizierung von doppelsträngiger DNA in unbekannten Proben verwendet werden kann.

Schalten Sie das Hitachi F 7,000 Spektral-Fluorimeter ein, um der Xenonlampe eine Aufwärmzeit von einer Stunde in Excel zu ermöglichen. Erstellen Sie eine Datei mit den Standard- und Probendaten und speichern Sie sie im durch Komma getrennten Werten-Format (CSV). Um das Fluorimeter einzurichten, klicken Sie zunächst auf die Schaltfläche „Methode“, die das Analysemethoden-Fenster öffnet.

Wählen Sie im Messbereich Photometrie aus dem Dropdown-Menü aus. Klicken Sie nun auf den Reiter Quantifizierung. Wählen Sie im Feld Quantifizierungstyp Wellenlänge aus, um anzugeben, dass die Fluoreszenzablesung unter Verwendung einer bestimmten Wellenlänge erfolgen wird.

Wählen Sie für den Kalibrierungstyp die erste Ordnung und für die Anzahl der Wellenlängen eins aus. Geben Sie Nanogramm pro Milliliter als Konzentrationseinheit ein. Stellen Sie sicher, dass die Felder manuelle Kalibrierung und Kurve durch Null erzwingen nicht ausgewählt sind. Wählen Sie bei Anzahl der Nachkommastellen zwei aus, geben Sie null für die untere Konzentrationsgrenze und 10.000 für das Feld obere Konzentrationsgrenze ein.

Klicken Sie anschließend auf den Instrumentreiter und wählen im Feld Datenmodus Fluoreszenz aus. Stellen Sie sicher, dass das Feld Chopping-Geschwindigkeit inaktiv ist, da es nur für Phosphoreszenzmessungen verwendet wird. Wählen Sie im Feld Wellenlängenmodus beide WL fest im Ex-WL-1-Feld aus und geben Sie im EM-WL-1-Feld 480 Nanometer ein.

Geben Sie 520 Nanometer ein. Lassen Sie alle anderen Felder unter EX und EM inaktiv. Stellen Sie sowohl den EX-Spalt als auch den EM-Spalt auf 5,0 Nanometer ein.

Über die Dropdown-Menüs bleibt das Feld vor dem PMT-Spannungsbereich von 1 bis 1000 Volt unmarkiert. Wählen Sie für die PMT-Spannung 700 Volt aus dem Dropdown-Menü aus. Wählen Sie außerdem zwei für die automatische Statistikberechnung, eins für die Wiederholungen, 0,1 Sekunden für die Integrationszeit und null für die Verzögerung.

Öffnen Sie nun die Registerkarte „Monitor“ und stellen Sie das Feld „Y-Achsen-Maximum“ auf 10.000 und die „Y-Achsen-Minimum“ auf null ein. Aktivieren Sie dann das Kästchen links neben „Datenverarbeitung nach Datenerfassung öffnen“ und gegebenenfalls das Kästchen links neben „Bericht nach Datenerfassung drucken“, um einen Bericht automatisch nach Abschluss der Messungen auszudrucken. Klicken Sie abschließend auf die Registerkarte „Allgemein“, um alle ausgewählten Parameter in den verschiedenen Registerkarten des Fensters „Analysenmethode“ unter einem neuen Dateinamen an einem angegebenen Speicherort zu speichern.

Klicken Sie auf die Schaltfläche „Okay“, um dieses Fenster zu schließen. Damit ist die Einrichtung der Instrumententestparameter abgeschlossen. Um den Mikroplattenreader einzurichten, klicken Sie auf die Taste MPR, um das MPR-Einrichtungsfenster in den Vordergrund zu holen.

Wählen Sie zuerst die Vertiefungen für die Standards aus. Klicken Sie beispielsweise auf die Position A1 und ziehen Sie die Maus bis E1. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche „Standardreihe“.

Dadurch werden die Positionen ausgewählt, die für die Standards verwendet werden sollen, wie durch die grüne Markierung hervorgehoben. Anschließend wählen Sie die Positionen für die Proben aus. Klicken Sie hierzu entsprechend auf die gewünschten Positionen auf der Platte und ziehen Sie mit gedrückter Maustaste über diese, und klicken Sie danach auf den Probenset-Button, wodurch die ausgewählten Positionen automatisch gelb markiert werden.

Wiederholen Sie den gleichen Vorgang für die Positionen, an denen die gewünschten Probenmessungen durchgeführt werden sollen. Um die Standards und Probendaten in die zuvor erstellte durch Komma getrennte Variablen-Datei zu laden, klicken Sie auf den Reiter „Welleninformationen“ im MPR-Setup-Fenster.

Wählen Sie die Schaltfläche „Load Well Information“ (Informationen zur Beladungsprobe) aus, und ein Fenster von Windows Explorer wird geöffnet, um die Datei „well information dot csv“ zu identifizieren. Nach dem Laden der Informationen sollte das Fenster die Daten als Tabelle anzeigen. Um eine Arbeitslösung des Pico-Green-Reagenz herzustellen, geben Sie 50 Mikroliter des 200×-Pico-Green-Reagenz zu 9,95 Millilitern TE-Puffer hinzu.

Für die Standardkurve bereiten Sie serielle Verdünnungen von Lambda-Doppelstrang-DNA in TE-Puffer für Endkonzentrationen von einem bis 100 Nanogramm pro Milliliter vor; pipettieren Sie 150 Mikroliter jedes Standards in die dafür vorgesehenen Vertiefungen einer 96-Loch-Platte. Danach pipettieren Sie 150 Mikroliter jeder Testprobe in die entsprechenden dafür vorgesehenen Vertiefungen der Platte. Fügen Sie nun mit einer Mehrkanalpipette 150 Mikroliter Pico-Green-Lösung in jede Vertiefung hinzu und mischen Sie die Lösung und die DNA-Proben.

Inkubieren Sie die Platte vorsichtig zwei bis fünf Minuten lang an einem dunklen Ort, um die Reaktion zu entwickeln. Klicken Sie auf die Anzeigetaste des MPR, um das MPR-Setup-Fenster in den Vordergrund zu bringen, und klicken Sie auf die Taste zum Positionstausch. Die Halteplattform für die Mikroplatte bewegt sich nach vorne aus dem Gerät heraus, öffnet die Tür des Mikroplattenlesegeräts und platziert die 96-Loch-Platte auf der Halteplattform, wobei das Loch A1 nach vorne zeigt; anschließend schließt sich die Tür des Mikroplattenlesegeräts.

Klicken Sie auf die Schaltfläche für die Anfangsposition, um Position A einer Mikroplatte in die Messposition zu bringen. Klicken Sie auf die Schaltfläche zur Bildschirmanzeige, um das Messfenster an die Spitze der Anzeige zu bringen. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Messen“, um die Messung der Standards und der unbekannten Proben zu starten.

Eine gute Kalibrierungskurve wird anhand der verschiedenen Parameter bewertet, die von der F 7,000-Software bereitgestellt werden. Beispielsweise weist diese ideale Kalibrierungskurve, die zur Quantifizierung von doppelsträngiger DNA unter Verwendung des Pico-Green-Farbstoffs erhalten wurde, einen berechneten Bestimmtheitskoeffizienten von 0,99993 auf. Das beschriebene Hochdurchsatzsystem ist eine serielle Anordnung von Technologien, zu denen der Pico-Green-Farbstoff, ein fluoreszierendes Spektralphotometer vom Typ Hitachi F 7,000 mit Mikroplattenleser sowie ein Softwareprogramm zur Automatisierung der Datenerfassung, -speicherung, -analyse und -darstellung gehören.

Die Kombination leistungsfähiger Technologien kann dem wachsenden Bedarf an einer genauen Analyse geringer Mengen doppelsträngiger DNA gerecht werden.