Ermittlung der Auswirkungen von BRCA1-Mutationen auf homologe Rekombination unter Verwendung von Zellen, die endogenes Wildtyp-BRCA1 Express

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, spezifische Varianten des BRCA1-Proteins mithilfe eines in-vitro-Homolog-Rekombinations-Assays zu testen. Dies wird erreicht, indem das endogene, wildtypische BRCA1-Protein durch die zu testende Variante ersetzt wird, und zwar durch die Transfektion von kurzen interferierenden RNA-Molekülen, die spezifisch für BRCA1 sind, sowie eines Plasmids zur erneuten Expression der zu testenden BRCA1-Varianten in Zellen. In einem zweiten Schritt werden zusätzlich zum kurzen interferierenden RNA-Molekül und dem Plasmid zur Expression des mutierten BRCA1 auch ein Plasmid zur Expression des ISCE1-Proteins transfiziert, welches DNA-Schäden an einer bestimmten Stelle im DNA-Genom der Testzelle verursacht. Anschließend werden die Zellen zwei bis drei Tage lang inkubiert, um die Entstehung von DNA-Schäden und deren Reparatur zu ermöglichen. Die Ergebnisse zeigen anhand einer Durchflusszytometrie-Analyse von GFP-exprimierenden Zellen, ob bestimmte Proteinvarianten des BRCA1-Proteins bei der DNA-Reparatur durch homologe Rekombination funktionell sind.

Diese Technik kombiniert zwei etablierte Methoden, um ein vielseitiges System zur Analyse spezifischer Proteinvarianten bei der Reparatur von DNS-Schäden durch homologe Rekombination zu schaffen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass frühere Methoden auf Zelllinien basierten, die einen genetischen Knockout von BRCA1 aufwiesen. Wir verwenden eine handhabbarere Zelllinie, die von HELOC-Zellen abstammt und die es ermöglicht, BRCA1 durch RNA-Interferenz des endogenen Proteins zu depletieren und gleichzeitig ein Testprotein in diesen Zellen wieder hinzuzufügen.

Da nun eine variante BRC1-Protein exprimiert wird, kann die homologe Rekombination getestet werden. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten aufgrund eines übermäßigen Zelltods während des Verfahrens. Es ist wichtig, die Transfektionsbedingungen sorgfältig einzustellen, um die Wirkung der Rekombinationsreaktion zu maximieren und gleichzeitig die Zytotoxizität zu begrenzen.

Vor Beginn dieses Protokolls wurde die HeLa DR13-9-Zelllinie etabliert, indem HeLa-Zellen mit dem P-D-R-G-F-P-Plasmid transfiziert wurden. Kultivieren Sie die Zelllinie auf 10 cm Petrischalen in Puromycin zur Selektion stabil transfizierter Zellen. Das Rekombinations-Substrat im P-D-R-G-F-P-Plasmid und in den stabilen Transformanten enthält zwei inaktive Allele von GFP. Ein Allel ist aufgrund der Einbindung der 18 Basenpaare langen Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym ISCE1 inaktiv.

In seiner kodierenden Sequenz erzeugt die Expression von ISCE1 in diesen Zellen einen doppelsträngigen DNA-Bruch oder DSB am zweiten Allel des inaktiven GFP. Der Teil seiner Sequenz, der mit der ISCE1-Stelle am ersten Allel korreliert, ist vom Wildtyp. Dieses zweite GFP-Allel kann als Sequenzdonor für die homologe Rekombinationsreparatur des DSB dienen und führt zu einem aktiven GFP-Allel, das mittels Durchflusszytometrie am Tag vor der ersten Transfektion leicht nachweisbar ist.

Beschaffen Sie eine 10 cm-Schale mit Hela DR 13-9-Zellen, die zu mindestens 90 % konfluent sind. Belösen Sie die Zellen mit einem Milliliter Trypsin für zwei bis drei Minuten. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von neun Millilitern D-M-E-M-F-B-S und mischen Sie die Zellsuspension durch Pipettieren gründlich. Geben Sie 40 Mikroliter der trypsinierten Zellen pro Vertiefung in eine 24-Loch-Platte, jeweils in 0,5 Milliliter D-M-E-M-F-B-S, und inkubieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid.

Am ersten Tag sollten die Zellen eine Konfluenz zwischen 40 und 50 % aufweisen. Beginnen Sie die Transfektion, indem Sie das irna zur Ausschaltung des endogenen b RCA eins und das B RCA eins Mutanten-exprimierende Plasmid in Optimum-Medium mischen. Anschließend kombinieren Sie die Nukleinsäuren mit Lip in Optimum-Medium.

Führen Sie die Lipectomy-Transfektion gemäß den Anweisungen des Herstellers nach der Transfektion durch. Bringen Sie die Zellen erneut zur Inkubation. Ersetzen Sie das Medium vier bis sechs Stunden später durch ein Medium, das keine Antibiotika enthält.

Geben Sie die Zellen am zweiten Tag zur Übernachteinzucht zurück. Lösen Sie die Zellen durch Zugabe von 0,3 Milliliter Tripel-Trypsin-Reagenz pro Vertiefung nach einer kurzen Inkubation bei 37 Grad Celsius, indem Sie die Zellen mehrmals mit dem Pipettiergerät im Trypsin-Reagenz auf und ab pipettieren. Sobald die Trypsinbehandlung abgeschlossen ist, überführen Sie die Zellen von der 24-Vertiefungs-Platte in eine 6-Vertiefungs-Platte, die zwei Milliliter D-M-E-M-F-B-S enthält, um die Trypsinaktivität zu stoppen.

Die Sechs-Well-Platte über Nacht unter den gleichen Bedingungen wie zwei Tage nach der initialen Transfektion inkubieren lassen. SIR A, die BRCA1-Mutante, die exprimierende Plasmid-DNA, und die ISCE1-exprimierende Plasmid in 62,5 Mikrolitern Optum vorbereiten. Diese Lösung mit 2,5 Mikrolitern LIPECTOMY 2060 und 2,5 Mikrolitern Optum mischen.

Führen Sie die Transfektion der Zellen nach einer vier- bis sechsstündigen Inkubation durch. Ersetzen Sie das Medium durch D-M-E-M-F-P-S ohne Antibiotika. Stellen Sie die Zellen am sechsten Tag wieder in den Inkubator.

Man setzt die Zellen in jeder Vertiefung durch Zugabe von 0,5 Milliliter Trypsin-Reagenz frei. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von zwei Milliliter D-M-E-M-F-B-S und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 1000 U/min für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter frischem D-M-E-M-F-B-S und analysieren Sie 10.000 Zellen pro Vertiefung auf GFP-Expression.

Mittels Durchflusszytometrie werden einzelne lebende Zellen anhand von Forward- und Size-Streulichtparametern ausgewählt. GFP-positive Zellen werden über den GFP-Fluoreszenzdetektor geleitet und die Ergebnisse als Histogramm dargestellt. Die verbleibenden Zellen können zur Fluoreszenzmikroskopie erneut ausplattiert werden.

Mittels Mikroskopie lässt sich nachweisen, dass BRCA1 den Signalweg für die Reparatur von doppelsträngigen DNA-Brüchen durch homologe Rekombination reguliert. Zellen, die eine Reparatur mittels homologer Rekombination durchlaufen haben, sind mittels Fluoreszenzmikroskopie leicht nachweisbar. Die Absenkung von BRCA1 durch RNA-Interferenz führt zu einem starken Rückgang der detektierten GFP-positiven Zellen.

Die Ausgabe der FCA ist ein Histogramm mit der GFP-Intensität pro Zelle auf der X-Achse und der Anzahl der Zellen auf der Y-Achse. In Abwesenheit des transfizierten, I-SCE1-exprimierenden Plasmids werden keine GFP-positiven Zellen detektiert.

Die Ergebnisse in den Spalten zwei bis sechs stammen alle von Zellen, in die am dritten Tag ein ISC-eins-exprimierendes Plasmid transfiziert wurde. In einem typischen Datensatz aus einem einzelnen Experiment sind 15,5 % der Zellen nach ISC-Eins-Expression und Kontroll-RNAi-Reduktion für ein irrelevante Gen GFP-positiv, verglichen mit der Reduktion von BRCA Eins und der Rückgabe eines leeren Plasmid-Vektors. Die GFP-Umwandlung sinkt auf 0,7 %. Die Zugabe von exogenem, wildtypischem BRCA Eins stellt die homologe Rekombination vollständig wieder her, was durch die Detektion von 15 bis 16 % GFP-positiven Zellen nachgewiesen wird.

Ebenso wurde die Expression einer weiteren Variante von unbekannter Signifikanz beobachtet. Die BRCA1-I21B-Mutation stellte die BRCA1-abhängige Funktion der homologen Rekombination vollständig wieder her. Die Wiederanbringung des BRCA1-M18T-Mutanten zeigte einen ähnlichen Effekt wie die Vektor-Kontrolle.

Da diese Variante in ähnlichen Mengen wie das endogene Protein exprimiert wird, legt dies nahe, dass die BRCA1-M18T-Variante in der homologen Rekombination nicht funktionsfähig ist. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, das Zellwachstum zu überwachen, darauf zu achten, dass die Zellen langsam und bei geringer Konfluenz wachsen, und die Menge des verwendeten Transfektionsgemischs zu reduzieren. Ebenso wichtig ist es, das Transfektionsmedium rechtzeitig zu entfernen.

Wir stellen fest, dass in den Tagen nach der Transfektion eine hohe zelltoxische Wirkung auftritt, wenn Antibiotika im Medium enthalten sind. Aus diesem Grund enthalten alle Medien ab dem ersten Tag nach der Entwicklung keine Antibiotika mehr. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Brustkrebsforschung, die Genetik von BRC1-Varianten mit unbekannter klinischer Signifikanz in Krebskliniken zu untersuchen.

Wir hoffen, dass der in dieser Arbeit entwickelte funktionelle BRC-one-Assay eine verbesserte Vorhersage der Auswirkungen von BRC-one-Varianten auf die Krebsanfälligkeit ermöglichen wird.