Computer-assisted Großflächige Visualisierung und Quantifizierung der Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Masse, Größenverteilung und Architektur

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, innerhalb einer begrenzten Stichprobe unverzerrte, repräsentative Daten zu sammeln und die komplexe dreidimensionale Struktur des Gewebes präzise zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst virtuelle Schnitte von immunhistochemisch gefärbten Pankreasschnitten aufgenommen werden. Anschließend werden die virtuellen Schnitte mit dem IHC-Virtueller-Schnitt-Makro in der Image-J-Software quantifiziert, und die Daten werden mit für Mathematica verfassten Skripten analysiert.

Anschließend wird eine 3D-Rekonstruktion der virtuellen Schnittebenen mithilfe von ImageJ durchgeführt. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, mithilfe der Slide-Book-Software einen Stapel einzelner Inselbildern aufzunehmen und die Bildstapel manuell in drei Dimensionen mittels Stereo Investigator zu kartieren. Letztendlich kann durch eine kombinierte Methode aus 3D-Bildgebung und manueller Kartierung eine präzise Architektur der Inseln mit 3D-Koordinaten für jede Inselzelle erzielt werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Adipositas- und Diabetesforschung zu beantworten, beispielsweise wie physiologische und pathophysiologische Bedingungen die Verteilung und Architektur der Inselzellenmasse im Pankreas beeinflussen.

Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Diagnose oder Therapie von Adipositas und Diabetes Melitis, da ein besseres Verständnis der Veränderungen in der Betazellmasse die Entwicklung und Bewertung therapeutischer Interventionen erleichtern wird. Obwohl die in der vorliegenden Studie beschriebenen Methoden spezifisch Einblicke in die dynamische immunhistochemische Analyse des Pankreas bieten, können sie ebenfalls auf eine Vielzahl anderer Organismen und Gewebe angewendet werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die computergestützten Analyse-Schritte schwer zu erlernen sind.

Aufgrund der Komplexität bei der Analyse solch großer Datensätze in zwei und drei Dimensionen beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie einen sauberen Objektträger, der einen vollständigen Schnitt einer immunhistochemisch gefärbten Bauchspeicheldrüse enthält, in der Halterung eines Fluoreszenzmikroskops platzieren. Öffnen Sie die Stereo-Investigator-Software und visualisieren Sie die Probe, indem Sie auf „Acquisition“ klicken.

Und dann Live-Bild. Bestimmen Sie die Belichtungsstufen für jeden Kanal mithilfe des Video-Histogrammfensters, das die Intensität der Fluoreszenz anzeigt. In diesem Beispiel wird Kanal zwei für DAP, Kanal drei für GFP, Kanal vier für RFP, Kanal fünf für sci five und Kanal sechs für SCI seven verwendet.

Passen Sie mithilfe des Kameraeinstellungsfensters die Belichtungszeit so an, dass die Fluoreszenzintensität abfällt. Am rechten Ende des Video-Histogramms kann das Bild mit dem Fokusrad des Mikroskops scharfgestellt werden. Um eine virtuelle Schnittebene zu erstellen, umranden Sie die Probe, indem Sie auf einen Punkt außerhalb der Probe auf dem Bildschirm klicken, wodurch ein Referenzpunkt markiert wird.

Klicken Sie anschließend entlang der Umrandung der Probe, bis die Kontur vollständig ist. Klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie „Kontur schließen“, um Anfangs- und Endpunkt zu verbinden. Sobald die Kontur geschlossen ist, erfassen Sie einen virtuellen Schnitt der Probe, indem Sie „Akquisition“ und dann „Virtuellen Schnitt erfassen“ auswählen. Wenn die Optionen für das Fenster des virtuellen Schnitts geöffnet werden, wählen Sie „Schnelle Aufnahme“ sowie die Deaktivierung der manuellen Steuerung.

Fokussieren, indem das Kontrollkästchen neben „manuell“ deaktiviert wird. Die Datei speichern. Die Vorkalibrierung kalibrieren, indem mit der rechten Maustaste geklickt und „Zur Fokusstandortliste hinzufügen“ ausgewählt wird.

Manuell mehrere zufällige Bereiche in der Vorschaudarstellung des virtuellen Schnitts fokussieren. Wenn mehrere Stellen fokussiert wurden, den virtuellen Schnitt durch Rechtsklick und Auswahl starten. Den virtuellen Schnitt mit Prefo starten. Nach Abschluss des virtuellen Schnitts für die erste Probe zum nächsten Kanal wechseln und die Belichtung entsprechend anpassen. Dieses Verfahren wird für jeden Kanal wiederholt, um die Quantifizierung von Ösen durchzuführen. Die Bilder werden mithilfe eines Image-J-Makros namens I-H-C-V-S verarbeitet, das zunächst die geladenen Bilder für die Analyse vorbereitet und anschließend Merkmale der Ösen wie die zelluläre Zusammensetzung quantifiziert.

Die I-H-C-V-S-Makros teilen den Stapel in ihre jeweiligen Farbkanäle auf. In Image J wird jedes Bild in eine achtbitige Schwarz-Weiß-Maske umgewandelt. Nach automatischer Helligkeitsschwellenbestimmung werden die einzelnen Kanalbilder arithmetisch zu einer zusammengesetzten Maske addiert.

Die integrierte Partikelanalyse von ImageJ im zusammengesetzten Bild identifiziert dann interessierende Bereiche oder ROIs, wobei Partikel, die kleiner sind als eine Beta-Zelle, ausgeschlossen werden. Die Quantifizierung der ROIs. Die Verwendung von ImageJ erzeugt eine Tabellenkalkulation mit Zellparametern.

Speichern Sie die aggregierten Ergebnisse in einer Excel-Tabelle. Speichern Sie Daten wie Fläche, Umfang, Rundheit, Fer-Durchmesser und Augenlöcher-Mittelpunkt für jedes Augenloch zusammen mit den entsprechenden, im Bild gekennzeichneten Nummern. Die rechnergestützte Analyse dieser Parameter kann wie im schriftlichen Protokoll beschrieben durchgeführt werden. Um Informationen wie die Verteilung und Häufigkeitsanalyse der Augenlöcher zu erhalten, führen Sie eine 3D-Rekonstruktion virtueller Schnitte durch Ausführung eines Skripts durch, das alle JP2-Bilder im Verzeichnis in TIF-Dateien umwandelt, das für die Erstellung und Quantifizierung dreidimensionaler Stapel aus den virtuellen Schnitten verwendete Format.

Hier wird ein Skript mit dem Namen I MJ zwei zwei tiff verwendet. Kopieren Sie das Skript in das Verzeichnis, das die JP zwei-Bilder enthält. Führen Sie das Skript über die Linux-Shell aus, indem Sie im Konsolenfenster „Punkt-Schrägstrich I am JP zwei zwei TIFF“ eingeben und anschließend die Eingabetaste drücken.

Nachdem alle aufgenommenen Bilder von JP2 in TIFF-Dateien konvertiert wurden, können sie zur Analyse in ImageJ verwendet werden. Öffnen Sie mit ImageJ alle Bilder der ersten Probe, in diesem Fall von einem menschlichen fetalen Pankreas, und kombinieren Sie sie, indem Sie nacheinander Bild, Farbe und dann Kanäle zusammenführen auswählen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Probe, nachdem alle Proben als einzelne Bilder zusammengefügt wurden. Bereinigen Sie die Bilder, indem Sie unerwünschte Bereiche mit dem Polygon-Auswahlwerkzeug markieren.

Füllen Sie sie aus, indem Sie Bearbeiten und anschließend Füllen auswählen. Konvertieren Sie jedes Bild in ein RGB-Farbbild. Erstellen Sie schließlich einen Stapel aus den Bildern, der danach mit dem Stack-Reg-Plugin weiter ausgerichtet werden kann.

Schließlich erzeugt das Zusammenführen der Kanäle und das Kombinieren der Bilder eine 3D-Montage aller Inseln im gesamten Pankreas. Um Bildstapel zu erfassen, positionieren Sie die ganzmontierten pankreatischen Inseln unter dem Mikroskop. Geben Sie Wasser hinzu, wenn Sie eine Wassereintauchobjektivlinse verwenden.

Öffnen Sie die Slide-Book-Software und rufen Sie die Aufnahme- und Fokussteuerung auf, indem Sie im Fokussteuerungsfenster Strg+Umschalt+E drücken. Stellen Sie das Objektiv je nach Größe der Öse auf 20-fache oder 40-fache Vergrößerung ein. Um mit dem Mikroskopokular die Ösen zu lokalisieren, stellen Sie den Binning auf zweifach ein und wählen Sie den Filterkanal „Benutzer 1“.

Im Fokussteuerungsfenster sollte die Emission auf 100 % Augen eingestellt und die Neutraldichtefiltereinstellung um einen Klick auf GFP-Augen angepasst werden; anschließend öffnen Sie den Boden, um die Probe im Slide-Book zu visualisieren. Kehren Sie dann zum Fokussteuerungsfenster zurück und schalten Sie den Filter auf Fix. Danach klicken Sie auf G-F-P-D-S. Verwenden Sie den Joystick, um die Öse im Kamerafenster so gut wie möglich zu zentrieren.

Fokussieren Sie auf eine Tiefe nahe dem Zentrum der Öse, wo die Zellen leicht zu erkennen sind. Wählen Sie im Fokussteuerungsfenster das zab aus. Verwenden Sie die Gerätesteuerung, um zur obersten Tiefe der Öse zu scrollen, bei der Strukturen klar erkennbar sind, und klicken Sie auf „obere Grenze festlegen“.

Scrollen Sie zum unteren Ende des Ösen und klicken Sie auf „set“. Unten klicken Sie auf „go“. Um zum Referenzpunkt im Erfassungsfenster zurückzukehren, klicken Sie auf „advanced“ und dann auf „alternate to channel mode“.

Stellen Sie den Binfaktor auf zwei ein und den Aufnahmetyp auf 3D auf der rechten Seite des Fensters, klicken Sie auf „obere und untere Positionen verwenden“ und kehren Sie nach der Aufnahme zum mittleren Volumen zurück. Stellen Sie die Schrittweite auf drei ein. Wählen Sie den Filtertyp „live“ unterhalb des Filtertyp-Felds aus.

Wählen Sie DAP, E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-U und SCI fünf DSU aus. Klicken Sie für jede Option unter „Exposition anpassen“ auf „Beste suchen“. Klicken Sie anschließend auf „Testen“, um sicherzustellen, dass die ausgewählte Belichtung geeignet ist.

Klicken Sie auf „Start“, um die Aufnahme zu beginnen. Wenn die Aufnahme abgeschlossen ist, passen Sie die Pegel nach Bedarf an und ändern Sie die angezeigte Farbe für RFP in Weiß. Speichern Sie den Objektträger und wechseln Sie zur Ansicht „TIFF-Serie exportieren“.

Geben Sie den Namen der Folie mit einem Bindestrich am Ende ein und speichern Sie ihn. Es werden Dutzende einzelner TIF-Dateien erstellt, daher kann es hilfreich sein, jeden Stapel von Bildern der Ösen in einem separaten Ordner zu speichern. Um die Bildstapel zuzuordnen, öffnen Sie die Stereo-Investigator-Software.

Visualisieren Sie das Bild, indem Sie die Bildstapel im Menü für die Bildskalierung öffnen. Stellen Sie den Abstand zwischen den Bildern auf drei Mikrometer ein, um eine zweifache Biegung zu korrigieren. Wählen Sie im Folienbuch „X- und Y-Skalierung überschreiben“ und verwenden Sie eine vorgegebene Quelle für die X- und Y-Skalierung.

Geben Sie für X- und Y-Mittelpunkt jeweils 0,65 ein und zoomen Sie durch Klicken auf den Vergrößerungsbutton und anschließend in die Mitte des gewünschten Ilium-Ausschnitts im Makrofenster heran, um mindestens eine Zelle zu markieren. Mit dem geeigneten Marker erscheinen Beta-Zellen grün. Alpha-Zellen erscheinen rot und Delta-Zellen weiß.

Kennzeichnen Sie die Zellen im Zentrum ihres Zellkerns, der blau erscheint, wenn die Probe mit DPI gefärbt wurde. Verwenden Sie Marker zwei, um Beta-Zellen zu markieren, Marker fünf, um Alpha-Zellen zu markieren, und Marker sechs, um Delta-Zellen zu markieren. Sobald mindestens eine Zelle markiert wurde, zeigen Sie die orthogonale Ansicht mithilfe des Symbols in der oberen Menüleiste an, und aktivieren Sie Z-Filter und symmetrisch.

Der Bereich sollte auf 15,00 eingestellt werden. Beginnen Sie bei 0,0 Z. Blättern Sie durch die Ebenen mit dem Mausrad und markieren Sie jede Zelle mit der entsprechenden Markierung, wobei jede Zelle nur einmal genau in der Mitte ihrer Tiefe markiert wird. Nachdem alle Z-Ebenen markiert wurden, kann das Kontrollkästchen für den Z-Filter deaktiviert werden.

Dadurch werden alle Marker aus allen Z-Ebenen angezeigt. Wenn jede Zelle markiert wurde, speichern Sie die Datei als DAT-Datei. Gehen Sie dann zu Datei-Export-Spurverfolgung.

Speichern Sie die Kontur als TXT-Datei. Klicken Sie abschließend auf neue Datendatei, um den Arbeitsbereich zu löschen, bevor Sie versuchen, neue Ösen abzubilden. Die Erstellung virtueller Schnitte aus einer immunhistochemisch gefärbten Pankreasprobe ermöglicht die Untersuchung der alpha-, beta- und delta-endokrinen Zellen im gesamten Pankreas gemeinsam als Inseln. Die immunhistochemische Färbung für Insulin ist in grün zu sehen, Glucagon in rot, Somatostatin in weiß und Dap in blau.

Die Bilder wurden anschließend nach automatischer Schwellenwertbestimmung in eine 8-Bit-Maske umgewandelt. Gezeigt ist hier das zusammengesetzte Überlagerungsbild. Die Analyse der Ösenverteilung mithilfe virtueller Schnitte ermöglicht jedoch auch die individuelle Auswertung in separaten Kanälen.

Hier sind Ansichten der einzelnen Kanäle dargestellt, um die Delta-Zellen, Beta-Zellen und Alpha-Zellen sichtbar zu machen. Eine Partikelanalyse wird an der zusammengesetzten Maske durchgeführt, wobei jede Öse nummeriert und in Blau hervorgehoben ist. Die Partikelanalyse der zusammengesetzten Masken wird als Datentabelle ausgegeben, die Parameter wie Fläche, Umfang, Rundheit und verschiedene Durchmesser für jede erkannte Öse enthält, deren IDs den nummerierten Markierungen auf der zusammengesetzten Maske entsprechen.

Die großflächige Analyse dieser Bilder führt zur Erstellung von Histogrammen zur Gesamtanzahl der Inselzellen und zur Verteilung ihrer Größe sowie zu detaillierten Vergleichen der Flächen von Alpha-, Beta- und Delta-Zellen. Die Kartierung der Inselzellen und die mathematische Analyse der zellulären Zusammensetzung und Architektur können eine einzelne Fokusebene aus einem 3D-rekonstruierten Stapel von Bildern menschlicher Inselzellen zeigen, die in Stereo Investigator hochgeladen wurden. Hierbei sind Beta-Zellen grün, Alpha-Zellen rot, Delta-Zellen weiß und die Zellkerne blau dargestellt.

Nach der Erfassung einzelner Augenflecken wurden hier Alpha-, Beta- und Delta-Zellen in verschiedenen Seeebenen markiert; fluoreszierende Aufnahmen und die entsprechenden Karten-Daten werden für drei unterschiedliche Fokusebenen im Abstand von 10 Mikrometern gezeigt. Sobald die Alpha-, Beta- und Delta-Zellen in verschiedenen Ebenen markiert wurden, kann der Augenfleck in 3D visualisiert werden. Gezeigt ist hier eine 3D-Rekonstruktion des viertelgeteilten Augenflecks, basierend auf den durch die Augenfleck-Mapping gewonnenen Koordinaten.

Außerdem kann die automatisierte mathematische Analyse abgebildeter Ösen die zelluläre Zusammensetzung und Architektur darstellen. Hier ist die relative Häufigkeit der Zell-Zell-Abstände zwischen zwei Zellen einer einzelnen Zellpopulation dargestellt. Ebenfalls dargestellt ist die relative Häufigkeit der Zell-Zell-Abstände zwischen zwei verschiedenen Zellpopulationen.

Auch dargestellt sind die kumulativen Wahrscheinlichkeiten der Zelle-zu-Zelle-Abstandsverteilungen für Alpha-zu-Alpha-, Beta-zu-Beta- und Delta-zu-Delta-Zellen. Der Kolmogorov-Smirnov- oder KS-Test kann an diesen Wahrscheinlichkeiten durchgeführt werden, um die entsprechenden KS-Distanzen zu erhalten. Nach Beherrschung der Methode kann die großflächige Bildgebung und Analyse eines gesamten Gewebeschnitts innerhalb von vier Stunden durchgeführt werden.

Die 3D-Rekonstruktion eines Gewebestücks kann innerhalb von 30 Minuten durchgeführt werden. Schließlich können die 3D-Bildgebung und die manuelle Kartierung in vier Stunden abgeschlossen werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, mit einer hochwertigen immunhistochemischen Färbung der Schnitte zu beginnen.

Die Genauigkeit der anschließenden Analyse hängt vollständig von den Rohdaten ab. Stellen Sie außerdem sicher, dass Ihre Computer über mindestens acht Gigabyte RAM verfügen, um eine solche groß angelegte Analyse nach ihrer Entwicklung verarbeiten zu können. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher nicht nur im Bereich Adipositas und Diabetes, sondern auch in zahlreichen anderen Bereichen, die die standardmäßige pathologische Analyse verwenden.

Es kann besonders nützlich sein, wenn die Verfügbarkeit von Proben begrenzt ist. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mithilfe standardisierter Techniken innerhalb einer begrenzten Stichprobengröße repräsentative, unverzerrte Daten erhebt. Die Auswahl nur eines bestimmten Bereichs mag nicht repräsentativ für das Gesamtbild sein, wie wir anhand unserer Studie zur Verteilung von Pankreasinseln gezeigt haben.