RNA-Interferenz in Ticks

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Technik der RNA-Interferenz bei Zecken mittels Injektion zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst doppelsträngige RNA des oder der Gene von Interesse synthetisiert wird. Die RNA wird anschließend in Zecken injiziert, die danach 24 Stunden lang in einer Feuchtigkeitskammer aufbewahrt werden.

Nach dieser Ruhephase werden die Zecken letztendlich an einem Tier wie beispielsweise einem Schaf füttern gelassen. Fütterungsparameter wie Gewicht, Häutung und Eiablage sowie die Expression des gezielten Gens oder der Gene von Interesse mittels Echtzeit-R-T-P-C-R werden bestimmt. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die den Effekt der Stilllegung gezielter Gene auf die Zeckenbiologie durch die Auswertung zeckenbiologischer Parameter und der Genexpression mittels Echtzeit-R-T-P-C-R belegen.

Unsere Gruppe arbeitet mit Zecken, um molekulare Vorgänge an der Grenzfläche zwischen Zecke und Erreger zu charakterisieren, und nutzt diese grundlegenden Erkenntnisse, um Methoden zur Bekämpfung von Zeckenbefall sowie zur Übertragung von Krankheitserregern auf Menschen und Tiere zu entwickeln. Die RNA-Interferenz hat sich in dieser Forschung als unverzichtbares Werkzeug etabliert, da sie die einzige verfügbare Methode zur genetischen Manipulation von Zecken darstellt. Die Funktion vieler Zeckengene ist unbekannt.

Die RNA-Interferenz ermöglicht es uns, die Rolle von Zeckengenen und der Genexpression in vielen Aspekten der Zeckenbiologie zu definieren, einschließlich Paarung, Fortpflanzung, Fütterung, Verdauung, Funktion der Speicheldrüsen und der Vektorfähigkeit der Zecke für die Übertragung von Krankheitserregern. Das Verfahren wird vom RNA-Interferenz-Team für Zecken aus unserem Labor demonstriert: Dr. Ed Lewin, der Doktorand Busby und ich selbst. Um doppelsträngige RNA herzustellen, synthetisieren Sie zunächst Oligonukleotidprimer, die T7-Promotorsequenzen für die In-vitro-Transkription von RNA enthalten.

Beispielsweise derma center vari lesin. Verwenden Sie die Oligonukleotidprimer D eight A a T 75 und D eight DVT 73, die hier dargestellt sind. Amplifizieren Sie das Zielgen mittels R-T-P-C-R unter Verwendung von 10 Pikomol jedes Oligonukleotidprimers und ein bis 10 Nanogramm gesamter Zecken-RNA.

Als Nächstes reinigen Sie das PCR-Produkt. Verwenden Sie anschließend acht Mikroliter oder etwa 100 Nanogramm, um doppelsträngige RNA herzustellen. Um die Zecken für die Injektion vorzubereiten, waschen Sie die Zecken zunächst in der folgenden Abfolge von Lösungen: Leitungswasser, 3 % Wasserstoffperoxid, zweimal destilliertes Wasser, 70 % Ethanol und zwei abschließende Spülungen mit destilliertem Wasser.

Führen Sie jede Waschung in einem 50-Milliliter-Wegwerfzentrifugenröhrchen durch Schütteln durch. Danach gießen Sie die Lösung durch ein feines Maschendrahtsieb ab. Trocknen Sie die Zecken auf Papierhandtüchern ab und portionieren Sie sie je nach Experiment in Gruppen von 20 bis 50.

Stellen Sie jede Gruppe in einen 1,25-Unzen-Kunststoffbecher mit dicht schließendem Deckel und beschriften Sie jeden Becher mit der entsprechenden Versuchsgruppe. Danach bilden Sie ein RNAi-Team aus drei Personen, das den Injektionsvorgang durchführen wird. Die erste Person positioniert jeden Zecken auf doppelseitigem Klebeband, das auf einem drei mal sechs Zoll großen Stück rotem Zahnwachs befestigt ist.

Die zweite Person injiziert die Zecken, und die dritte beobachtet die Zecken nach der Injektion, bläst Kohlendioxid auf die Zecken, um sie zu aktivieren, und zählt die lebenden Zecken, um sie anschließend in Becher zu überführen, die mit der Nummer der Versuchsgruppe beschriftet sind. Alle Teammitglieder müssen Einweghandschuhe tragen. Um den Injektionsprozess bei den Zecken zu beginnen, fangen Sie eine Zecke mit feinen Dumont-Forceps ein und legen Sie sie dorsal nach unten auf doppelseitiges Klebeband, das auf einer roten Wachsplatte befestigt ist. Positionieren Sie die Zecken in Gruppen zu je fünf. Legen Sie einen kleinen Streifen Abdeckband über die Mundwerkzeuge aller fünf Zecken.

Um sie weiter einzuschränken, lassen Sie den größten Teil des Körpers frei, damit der Zeckeninjektor den Injektionsvorgang beobachten kann. Stechen Sie zur Injektion der Zecke mit einer Mono-Eject-Insulinspritze, die mit einer 29-Gauge-Halbzoll-Nadel ausgestattet ist, ein Loch in das untere rechte Quadrant der ventralen Oberfläche des Exoskeletts. Injizieren Sie anschließend unmittelbar 0,2 bis 0,5 Mikroliter einer doppelsträngigen RNA-Lösung mit einer speziell angefertigten Hamilton-Spritze und einer 33-Gauge-ein-Zoll-Nadel mit 45-Grad-Abgeschrägung; führen Sie die Nadel tief in den Zeckenkörper ein, um eine sichere Platzierung und Retention der doppelsträngigen RNA zu gewährleisten.

Auch wenn nach der Injektion Flüssigkeit austritt, gewährleistet eine tiefe Nadelplatzierung, dass eine ausreichende Menge doppelsträngiger RNA in die Zeckenkörperhöhle injiziert wird, um eine Genstilllegung zu bewirken; es ist darauf zu achten, keine Überinjektion durchzuführen. Das Injizieren der Zecken führt zum Verlust von Hämolymphe und zum Absterben der Zecke. Unmittelbar nach der Injektion sind die Zecken mit feiner Pinzette vom doppelseitigen Klebeband abzuheben und in einen Kunststoff-Regenerationsbehälter zu überführen.

Die Zecken verbleiben nach der Injektion kurzzeitig inaktiv, sollten aber bald darauf beginnen, sich in der Schale zu bewegen. Aktivieren Sie die Zecken, indem Sie Kohlendioxid auf sie ausatmen. Sobald die Zecken kriechen und aktiv sind, heilt die Injektionswunde rasch, und sie werden höchstwahrscheinlich überleben.

Zählen Sie die Zecken in jeder Versuchsgruppe und geben Sie jede Gruppe in einen beschrifteten Plastikbecher mit fest sitzendem Deckel. Ersetzen Sie alle Zecken, die in der aktuellen Gruppe sterben, bevor Sie die nächste Versuchsgruppe injizieren. Reinigen Sie die Hamilton-Spritze vor der Injektion der nächsten Versuchsgruppe, indem Sie sie mit frischem 3 %igem Wasserstoffperoxid füllen und anschließend entleeren.

15-mal, gefolgt von 15 Spülgängen mit steriler Wasser. Achten Sie darauf, den Kolben der Hamilton-Spritze nicht zu verbiegen, da er sonst nicht mehr gleichmäßig gleitet und nicht auf die sanfte Berührung reagiert, die für die Zeckeninjektion erforderlich ist. Nach der Injektion bringen Sie die Zecken in eine Kammer mit einem Behälter, der mit Wasser und Kaliumsulfat gefüllt ist, um eine hohe Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten, und lassen Sie sie dort einen Tag lang.

Bringen Sie anschließend einzelne Zecken in Zeckenfütterungszellen ein, die an ein Schaf geklebt sind, und lassen Sie sie mit einer gleichen Anzahl nicht injizierter männlicher oder weiblicher Zecken füttern, je nachdem, welches Geschlecht nicht injiziert wurde. Sammeln Sie die weiblichen Zecken nach Abschluss der Fütterung von der Fütterungszelle ab, nach etwa 10 Tagen oder sobald die Kontrollweibchen abgefallen sind, und inkubieren Sie jede Gruppe von Zecken in einer Feuchtekammer, bis die Eiablage abgeschlossen ist. Bewerten Sie die Eiablage je Gruppe, indem Sie die Eimasse wiegen, die von allen Zecken einer Gruppe produziert wurde, um das Zecken-Phänotyp nach der Fütterung zu bewerten.

Bestimmen Sie die Anzahl der überlebenden Zecken und berechnen Sie das Zeckengewicht sowie die Eiablage und die Fruchtbarkeit der Eier. Abhängig vom Zielgen und den Studienzielen können weitere Analysen durchgeführt werden, um die Genstilllegung mittels R-T-P-C-R zu bestätigen. Nach der Fütterung dissezieren Sie die Speicheldrüsen und Därme einzelner Zecken aus den Gruppen mit Kontrollinjektion und mit doppelsträngiger RNA-Injektion und extrahieren anschließend die Gesamt-RNA aus den einzelnen Gewebeproben.

Analysieren Sie die Transkripte des Zielgens in einzelnen Geweben mittels Echtzeit-RTPCR und normalisieren Sie die RNA-Spiegel gegenüber der 16S-ribosomalen RNA der Zecke. Führen Sie mithilfe der Gen-Norm-Methode am Ende der Reaktion Schmelzkurvenanalysen durch, um sicherzustellen, dass jeweils nur ein Amplikon gebildet wird und dass die Amplikone in jedem Probe in dem gleichen Temperaturbereich konsistent denaturieren. Vergleichen Sie die normalisierten CT-Werte für die mRNA-Spiegel zwischen kontrollinjizierten und mit doppelsträngiger RNA injizierten Zecken unter Verwendung des Student’schen t-Tests.

Das hier beschriebene Protokoll wurde in unserem Labor für die RNAi-Technik bei vielen verschiedenen exotischen Zeckenarten verwendet. Die Menge an doppelsträngiger RNA, die in die Zecken injiziert wird, variiert je nach der Größe der Zecke. Größere Zeckenarten können ein größeres Volumen aufnehmen.

Die Referenzen finden sich im begleitenden schriftlichen Teil des Protokolls. Wenn das Protokoll korrekt durchgeführt wird, sollte die Mortalität nach der Injektionsprozedur nach 24 Stunden weniger als 5 % betragen. Ein typisches Phänotyp nach der Genstilllegung bei Zecken ist hier dargestellt, wobei eine Gruppe von Zecken mit Pools aus doppelsträngiger RNA injiziert wurde, die zur Identifizierung zeckenprotektiver Antigene verwendet wurden.

Bei Zecken, die mittels Lichtmikroskopie untersucht werden, können zelluläre Degenerationen in den Zeckengeweben beobachtet werden. Phänotypische Veränderungen können zudem mit einem Funktionsverlust einhergehen. Beispielsweise führt die RNAi von SUBIN zu sterilen Männchen, die nicht erfolgreich mit Weibchen paaren können, nach RNA-Interferenz und Zecken.

Andere Methoden können verwendet werden, um die Auswirkungen der Genstilllegung auf die Gen- und Proteinausprägung sowie auf die Zeckenbiologie zu untersuchen, einschließlich Echtzeit-R-T-P-C-R, Licht-, Elektronen- oder konfokaler Mikroskopie. Genomik oder Proteomik. Die RNA-Interferenz kann auch in Zeckenzellkulturen durchgeführt werden und bietet eine in-vitro-Methode zur Untersuchung von Interaktionen zwischen Zeckenzellen und Pathogenen.