Mutagenese und Functional Selection Protocols for Directed Evolution von Proteinen in E. coli

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine zufällige Mutantenbibliothek für eine gegebene Ziel-DNA-Sequenz zu erstellen und Mutanten mithilfe einer halbquantitativen funktionellen Selektion schnell zu identifizieren und zu charakterisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Plasmid mit einer Replikationsursprungsstelle, das die Zielsequenz enthält, in den Mutator-Stamm transformiert wird. Nach dem Aufplattieren und einer Übernachtinkubation der Zellen werden diese geerntet und das Zielplasmid isoliert, um die Mutantenbibliothek zu erhalten. Anschließend wird die Mutantenbibliothek in einen Detektionsstamm transformiert, um die Mutationen im zweiten Teil des Protokolls zu charakterisieren. Eine Wachstumsgradientenplatte wird hergestellt und bakterielle Kulturen des Detektionsstamms werden in eine separate Petrischale mit weichem Aer geladen.

Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, diese Bakterienkulturen auf den Gradienten abzustempeln. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die Veränderungen im Phänotyp-Profil einer gegebenen Zielsequenz anhand von Wachstumsunterschieden auf einem Wirkstoffgradienten zeigen. Dieses Video stellt eine Methode zur gerichteten Evolution von Proteinen in E. coli vor.

Dieser Prozess ahmt die natürliche Evolution bei der Erzeugung zufälliger Nährstoffbibliotheken nach, gefolgt von einer Selektion, die diese Vielfalt einschränkt. Dadurch verbessert er unsere Fähigkeit, neue biochemische Aktivitäten für industrielle oder biomedizinische Zwecke zu erzeugen. Dieses Verfahren besteht aus zwei Komponenten: der Erzeugung einer zufälligen Mutantenbibliothek und der funktionellen Selektion, um Funktionsgewinn-Mutationen zu erhalten. Die Demonstration dieses Verfahrens wird Jennifer Allen, eine Technikerin aus meinem Labor, durchführen.

Vor Beginn dieses Protokolls wurden elektrokompetente JS 200 Zellen, die eine Variante der DNA-Polymerase I mit geringer Fidelity (niedriger Treue) oder eine Low-Fidelity-Pol I, die zuvor wie im schriftlichen Protokoll beschrieben hergestellt wurde, verwendet. Diese Zellen enthalten ein temperatursensitives Allel von Pol I, sodass die Aktivität der Low-Fidelity-Pol I bei 37 °C vorherrscht. Ein Zielplasmid, das ein ColE1-Replikationsursprung mit der Zielsequenz enthält, die neben dem Replikationsursprung kloniert wurde. Low-Fidelity-Pol I initiiert die ColE1-Plasmidreplikation und führt dadurch Mutationen ein, um die Mutagenese zu starten.

Vermischen Sie 40 µL elektrokompetenter Zellen mit 30 bis 250 Nanogramm Ziel-Plasmid-DNA in einer 2-mm-Kammer. Führen Sie die Elektroporation mit einem Impuls von 1800 Volt durch. Überprüfen Sie die Zeitkonstante (TC), um einheitliche Bedingungen für jede Probe sicherzustellen.

Im Idealfall beträgt die TC fünf bis sechs Millisekunden. Lassen Sie das DNA-Gemisch der Zellen für 40 Minuten in einem Milliliter LB-Brühe bei 37 °C unter Schütteln mit 250 U/min regenerieren. Verwenden Sie eine 100 mm große LV-Agro-Petri-Schale, die zuvor auf 37 Grad Celsius vorgewärmt und mit den geeigneten Antibiotika versetzt wurde, um beide Plasmide auszuwählen. Impfen Sie die regenerierten Zellen in geeigneter Verdünnung aus, um eine annähernd rasenförmige Konzentration zu erhalten, die als deutliche, aber nicht zählbare Anzahl von Kolonien definiert ist, wie in diesem Beispiel gezeigt.

Nach der Übernachtinkubation die bakteriellen Kolonien der Petrischalen mit LB-Brühe ernten. Plasmid-DNA aus den geernteten Zellen isolieren; das erhaltene Plasmid-DNA stellt die zufällige Mutantenbibliothek dar.

Führen Sie einen Restriktionsverdau durch, indem Sie die Plasmidbibliothek mit einem Restriktionsenzym schneiden, das sowohl das Zielplasmid als auch den Träger linearisiert. Führen Sie an einem Plasmid eine analytische Agarosegelelektrophorese an der isolierten Plasmid-DNA durch, um Qualität und Menge zu bestätigen. Sobald die Plasmide verifiziert sind, verdauen Sie ein Mikrogramm der Bibliothek mit einem Restriktionsenzym, das den Trägerlinearisiert, das Zielplasmid jedoch nicht schneidet.

Nach Abschluss des Restriktionsverdaus wird die Bibliothek mithilfe eines DNA-Reinigungs-Kits aufgereinigt. Abschließend wird die gereinigte Bibliothek in einen Auslesestamm transformiert, um die Mutationen zu charakterisieren. Um mit der Herstellung des Gradienten zu beginnen, markieren Sie 10 gleichmäßig verteilte Spuren entlang einer Kante der Unterseite der quadratischen Petrischale.

Stellen Sie die Schale schräg, sodass die markierte untere Kante um sieben Millimeter angehoben ist. Gießen Sie 25 Milliliter warmes LB-Agar, das gut mit einer geeigneten Konzentration des Selektionsmittels vermischt wurde, in die Schräge. Dies ist die untere Schicht des Gradienten.

Stellen Sie sicher, dass der LB-Agar die Petrischale so bedeckt, dass das erhöhte, markierte Ende der Schale etwa einen Millimeter LB-Agar enthält und der tiefer liegende Teil etwa acht Millimeter. Decken Sie die Schale mit dem Deckel KU zur Belüftung ab und lassen Sie den Agar 10 bis 15 Minuten lang erstarren. Nachdem die untere Schicht des LB-Agars erstarrt ist, stellen Sie die Schale auf eine ebene Fläche.

Geben Sie anschließend 25 Milliliter warmes LB-Agar ohne Selektionsmittel darauf, um die erste Agar-Oberfläche zu überziehen, und achten Sie darauf, die gesamte untere Schicht vollständig zu bedecken. Decken Sie die Platte mit dem Deckel KU zur Belüftung ab und lassen Sie das Agar 10 bis 15 Minuten lang erstarren, um die Abdruckübertragung der Bakterien durchzuführen. Beschaffen Sie zunächst Bakterienkulturen des Reporterteststamms und verdünnen Sie diese so, dass sie identische Zelldichten aufweisen, mit einer optischen Dichte bei 600 Nanometern von weniger als 1,0.

Als Nächstes überführen Sie zwei Milliliter flüssigen Weichagar, der auf 42 Grad Celsius temperiert wurde, auf den Boden einer 100 Millimeter runden Petrischale, pipettieren 40 Mikroliter der Bakterienkultur in den Weichagar und mischen durch Schaukelbewegungen der Schale. Bestreichen Sie die lange Kante des Glasobjektträgers mit der Weichagarmischung. Richten Sie dann die beschichtete Kante des Objektträgers an der unteren Markierung der Gradientenschale aus.

Berühren Sie den Objektträger mit der Oberfläche des Agars. Eine leichte Berührung genügt, um einen Streifen des weichen Agars auf die Gradientenoberfläche zu übertragen. Der Objektträger wird anschließend zur Reinigung und Wiederverwendung beiseitegelegt.

Wiederholen Sie diesen Vorgang. Die verbleibenden Proben und experimentellen Kontrollen sollten in jede Gradientenplatte aufgenommen werden. Werden mehrere Gradienten durchgeführt, inkubieren Sie die Gradientenplatte über Nacht bei 37 Grad Celsius in umgekehrter Position (Deckel unten). Die Inkubationszeiten und -temperaturen können je nach verwendeter Bakterienstamm-Ablesung variieren, aber eine Übernacht-Inkubation bei 37 Grad Celsius ist in der Regel ausreichend für sichtbares Wachstum.

Schließlich die Zellvermehrung abbilden und analysieren, wie in dem schriftlichen Protokoll beschrieben. Dargestellt sind Bilder eines Auslesestamms, der entweder mit der nicht mutierten P-G-F-U-V- oder einer PG-FPUV-Mutantenbibliothek transformiert wurde und durchlaufen wurde. Nach vier Runden Mutagenese deuten dunkle oder schwach leuchtende Kolonien auf Plasmide hin, die Mutationen enthalten, die GFP inaktivieren.

Diese Abbildung zeigt die Häufigkeit von Mutationen im gesamten neutralen Bereich des Zielplasmids in Intervallen von 100 Basenpaaren. Beachten Sie, dass die Mutationen über die gesamte Plasmidsequenz auftreten, jedoch mit der höchsten Häufigkeit in der Nähe des Replikationsursprungs. Hier wird das Wachstum von Mutanten entlang eines Wirkstoffgradienten dargestellt.

Der Abstand, um den das Wachstum in Richtung der Spitze des Gradienten erfolgt, zeigt das unterschiedliche Resistenzprofil gegenüber dem Wirkstoff unter den Mutanten. In diesem Beispiel wurden Plasmidbibliotheken der humanen oxidativen Demethylase ABH zwei auf Mutanten mit erhöhter Resistenz gegenüber Methylmethansulfonat mittels Wirkstoffselektionsgradienten zwei untersucht. Solche Bibliotheken, die zwei beziehungsweise vier Iterationen des Mutageneseprotokolls repräsentieren, werden im Vergleich zum ursprünglichen Wildtyp und dem leeren Vektor gezeigt.

Die weiße Linie bezeichnet die Schwelle, oberhalb derer einzelne mutante Kolonien isoliert wurden. Für eine weitere phänotypische Analyse werden Beta-Lactamasemutanten, R 1 64 H und E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R, die zuvor mittels Low-Fidelity-P-one-Mutagenese sowie Astri- und M-Selektion identifiziert wurden, auf einem Cefotaxim-Gradienten von 0,4 Mikrogramm pro Milliliter und vier Mikrogramm pro Milliliter dargestellt. Ein Schutz gegen Cefotaxim weist auf eine erweiterte Breitspektrum-Beta-Lactamase-Aktivität hin.

Beachten Sie, dass das Wildtyp-Beta-Lactamase-Enzym im Vergleich zu Zellen, die einen leeren Vektor exprimieren, keinen Schutz verleiht. Daher stellen diese Mutanten eine Anpassung oder die Evolution einer neuen biochemischen Aktivität dar. Hier haben wir eine leistungsstarke Kombination aus Mutagenese und funktioneller Selektion für die Generierung neuer biochemischer Aktivitäten vorgestellt.

Über eine funktionelle Selektion kann entweder durch Drogenauswahl oder durch genetische Komplementation erreicht werden, wobei die Fähigkeit ausgenutzt wird, eine große genetische Diversität zu erzeugen. Um vorbestehende Proteinfunktionen zu optimieren oder eine gezielte Pathogenese durchzuführen, muss die Pathogenese möglicherweise auf eine bestimmte Sequenz beschränkt werden. Dies lässt sich leicht durch Klonierung bewerkstelligen.

Außerdem kann eine Mutagenese von einer funktionellen Selektion entkoppelt werden, um charakteristische Angriffsmuster oder mutatorische Abdrücke zu erhalten.