Hefekolonie Embedding-Methode
22. März 2011
Eine Methode zur Einbettung von Hefe-Kolonien ermöglicht Schnitte für Licht-und Elektronenmikroskopie. Dieses Protokoll erlaubt die Bestimmung der Verteilung der sporenbildenden Zellen und pseudohyphal Zellen innerhalb Kolonien bietet ein neues Werkzeug zum Verständnis der Organisation von Zelltypen innerhalb eines Pilz-Gemeinschaft.
Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Hefekolonien einzubetten. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Kolonie zusammen mit dem darunterliegenden Agar von einer Agarplatte entfernt, auf mehrere Tropfen geschmolzenes Agar gegeben und umgehend mit weiterem geschmolzenen Agar bedeckt wird. Anschließend wird überschüssiges Agar von der Kolonie abgetragen, um sie klein genug zu machen, damit sie in eine Form passt.
Die eingebettete AER-Kolonie wird anschließend fixiert, gefärbt, dehydriert und schließlich mit Spurr-Harz infiltriert. Der Block wird dann in eine Form mit zusätzlichem Spurr-Harz gegeben und bis zur Aushärtung inkubiert, bevor er geschnitten wird. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die mittels Licht- oder Elektronenmikroskopie die Verteilung der Zelltypen innerhalb einer Hefe-Kolonie zeigen.
Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Rasterelektronenmikroskopie besteht darin, dass sie die Bestimmung der inneren Struktur der Kolonie ermöglicht. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der mikrobiellen Entwicklung zu beantworten, beispielsweise die Verteilung von Zelltypen innerhalb von Kolonien. Diese Methode lieferte Erkenntnisse über die Struktur von croce CAC-Kolonien, ist jedoch vermutlich auch auf andere Mikroorganismen anwendbar.
Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da das Handhaben und Einbetten von Kolonien anhand eines schriftlichen Protokolls schwer zu erlernen sein kann. Die Idee zu dieser Methode entstand aus einigen genetischen Daten, die wir 2002 veröffentlichten und die darauf hindeuteten, dass Sporen in Kolonien nicht gleichmäßig verteilt sind. Wir haben eine Methode zur Schnittführung von Kolonien angepasst, die von engelberg im fin-Labor entwickelt wurde.
Beginnen wir also. Inkubieren Sie Wildtyp-Saccharomyces-cerevisiae-Hefe auf Agarplatten bei 30 Grad, bis etwa 300 Kolonien vorhanden sind. Entfernen Sie mithilfe eines schmalen Spatels einzeln Kolonien mit einem Durchmesser von ein bis zwei Millimetern von der Platte.
Danach mit einer Ein-Milliliter-Pipette mehrere Tropfen von 2 % Agar bei 42 Grad Celsius auf einen Mikroskopobjektträger geben und sofort die Kolonie mit der Agarseite nach oben aufbringen, bevor der Agar erstarrt. Weitere Tropfen Agar auf die Kolonie geben und den Agar vollständig erstarrten lassen, wobei sichergestellt werden muss, dass die gesamte Kolonie, einschließlich der Oberseite der Kolonie, vom Agar umschlossen ist. Bei allen nachfolgenden Protokollschritten mit einem Rasierklingenmesser verfahren.
Schneiden Sie die AER um die Kolonie herum zurecht und legen Sie den AER-Block mit der Kolonie in ein 3,5-Milliliter-Bo-Silikat-Schraubglas mit Verschluss, das 2 % Paraformaldehyd und 2 % Glutaraldehyd enthält. Die Kolonien müssen zur Fixierung einzeln verarbeitet werden, um Austrocknung zu verhindern; jedoch können bis zu 10 Kolonien im selben Gefäß platziert werden. Lassen Sie die Kolonien sieben Tage lang bei vier Grad Celsius stehen.
Nach einer Woche das Fixierungsmittel entfernen und die Agri-Kolonien zweimal mit jeweils etwa 1,5 Milliliter 0,15 molarer Natriumlösung bei pH 7,2 waschen. Nach jedem Waschschritt 15 Minuten auf Eis inkubieren, ohne zu schütteln. Danach zwei weitere Waschungen durchführen.
Unter Verwendung von 1,5 Milliliter eines X-OS-Puffers, bestehend aus 100 Millimolar Monokaliumphosphat, 10 Millimolar Magnesiumchlorid bei pH 6,0, jeweils nach jeder Waschung fünf Minuten auf Eis inkubieren. Anschließend mit demselben Gefäß die hier und im schriftlichen Teil dieses Protokolls aufgeführte Behandlung mit Osmium sowie die Waschschritte durchführen. Danach erneut mit demselben Gefäß am nächsten Morgen die hier und im begleitenden schriftlichen Protokoll aufgeführten stufenweisen Dehydrierungen durchführen.
Bereiten Sie das Spurs-Reagenz wie hier und in der beigefügten schriftlichen Anleitung beschrieben zu. Waschen Sie die Agri-Blöcke unmittelbar anschließend fünfmal je 10 Minuten lang mit jeweils 1,5 Milliliter 100 % Ethanol bei Raumtemperatur. Nach dem letzten Ethanolwaschgang entfernen Sie nur so viel Ethanol, dass der Agri-Block weiterhin bedeckt bleibt.
Unter Verwendung einer Pasteurpipette etwa 0,5 Milliliter Spurs-Reagenz in das Gefäß geben und 15 Minuten lang bei niedriger Geschwindigkeit auf einem Rotor vermischen. Nach der Rotation bei Raumtemperatur das Gefäß 30 Minuten lang stehen lassen. Anschließend die Lösung vollständig entfernen.
Dann 1,5 Milliliter Spurs-Reagenz hinzufügen, um den Agri-Block zu bedecken. Das Röhrchen erneut 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Rollwälzer rotieren lassen und anschließend 30 Minuten stehen lassen. Diesen Waschschritt wiederholen.
Wiederholen Sie den Schritt noch dreimal. Nach den letzten 30 Minuten entfernen Sie das Spurs-Reagenz und geben frisches Spurs-Reagenz hinzu, um die Blöcke zu bedecken. Lassen Sie die Agri-Blöcke vier Stunden bei Raumtemperatur stehen.
Ersetzen Sie das Spurs-Reagenz und rotieren Sie über Nacht. Am folgenden Morgen ersetzen Sie das Spurs-Reagenz erneut und lassen die Gefäße bis zum nächsten Tag rotieren. Am übernächsten Morgen geben Sie das Spurs-Reagenz in nummerierte Silikonformen, sodass der Boden der Formen gerade bedeckt ist.
Als Nächstes die Agar-Blöcke in die Formen geben und vier Stunden lang bei 60 Grad Celsius inkubieren. Nach vier Stunden die Formen mit weiteren Sporen, Reagenz, auffüllen und über Nacht bei 60 Grad Celsius inkubieren. Die Blöcke anschließend aus den Formen nehmen, um sie zu schneiden.
Ein Beispiel für ein Lichtmikrograf eines Schnitts durch das Zentrum einer Wildtyp-S. visiae-Hefekolonie ist hier dargestellt. Diese Hefe ist ein Wildtyp-Stamm, der aus Baumexsudaten isoliert wurde. Die Kolonie wurde vor dem Einbetten sechs Tage lang auf YNA-Medium inkubiert.
In dieser Abbildung sind asai-, pseudo-hyphäre und ovoide Hefezellen leicht unterscheidbar, und der Bereich der Kolonie, der das darunterliegende Agarmedium infiltriert, ist ebenfalls erkennbar. Offene Pfeile zeigen repräsentative asai-Zellen, ausgefüllte Pfeile zeigen repräsentative ovoide vegetative Zellen, ausgefüllte Pfeilspitzen zeigen Ketten verlängerter Zellen und si. Diese Abbildung ist ein Beispiel für ein Elektronenmikroskopbild aus einer Dünnschnittpräparation eines Labormusters der Hefe SH 1 0 2 0 und W 3 0 3. Hintergrund.
Die Kolonie wurde sechs Tage lang auf YNA-Medium vor der Schnittführung inkubiert. Das Bild zeigt einen Bereich der Kolonie mit einer hohen Häufigkeit von sporulierten Zellen. Ein Pfeil weist auf die Doppelschichtstruktur der Sporenwand hin.
In Teil A zeigen wir einen Ausschnitt einer vier Tage alten Kolonie mit einem Raster aus 15 Rechtecken, das in Teil B über das Bild gelegt ist. Die Häufigkeit sporenbezogener Zellen in jedem Rechteck wird durch 15 Balken dargestellt, die den 15 Rechtecken in Teil A entsprechen. Die Daten zeigen den Mittelwert und den Standardfehler von vier unabhängigen vier Tage alten Kolonien. In Teil C sind die Mittelwerte und Standardfehler für vier unabhängige acht Tage alte Kolonien dargestellt. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von zwei Wochen durchgeführt werden, wobei ein ganzer Tag sowie mehrere Tage mit einer bis drei Stunden benötigt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Lösungen unverzüglich hinzuzufügen, damit die Schnitte nicht austrocknen, nachdem dieses Verfahren durchgeführt wurde.
Andere Methoden, wie die immunoelektronenmikroskopische Untersuchung, könnten möglicherweise verwendet werden, um die Verteilung von Zellen zu bestimmen, die bestimmte Proteine nach ihrer Entwicklung exprimieren. Mithilfe dieser Technik konnten wir nicht nur die Musterung sporulierender Zellen, sondern auch die Musterung von Pseudo-Hyphen-Zellen in croce-CCI-Kolonien untersuchen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Hefe-Kolonien zum Schneiden einbettet.
Vergessen Sie nicht, dass viele der in diesem Protokoll verwendeten Mikroskopie-Reagenzien äußerst gefährlich sein können. Denken Sie daran, eine Abzugshaube zu verwenden, Schutzkleidung zu tragen und die Reagenzien ordnungsgemäß zu entsorgen. Gut, das war's.
Vielen Dank fürs Zuschauen. Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
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Übersicht
In diesem Artikel wird eine Methode zur Einbettung von Hefekolonien vorgestellt, die das Schneiden von Schnitten für die Licht- und Elektronenmikroskopie ermöglicht. Das Protokoll erleichtert die Analyse von sporulierenden und pseudohyphalen Zellen innerhalb von Kolonien und trägt zum Verständnis der Zelltyporganisation in Pilzgemeinschaften bei.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Mikrobiologie
- Zellbiologie
- Pilzbiologie
Hintergrund
- Hefekolonien weisen vielfältige Zelltypen auf.
- Das Verständnis der Zellverteilung ist entscheidend, um Pilzgemeinschaften zu untersuchen.
- Herkömmliche Methoden liefern möglicherweise keine detaillierten Einblicke in die Zellorganisation.
- Diese Methode bietet einen neuen Ansatz zur Visualisierung.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines Protokolls zur Einbettung von Hefe-Kolonien.
- Möglichmachung einer detaillierten Analyse der Verteilung von Zelltypen.
- Verbesserung des Verständnisses der Organisation von Pilzgemeinschaften.
Verwendete Methoden
- Entfernung von Hefe-Kolonien von Agarplatten.
- Einbetten der Kolonien in geschmolzenen Agar.
- Trimmen des überschüssigen Agars, um ihn an Formen anzupassen.
- Fixierung, Färbung, Dehydratisierung und Infiltration mit Harz.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Einbettung von Hefe-Kolonien für die Mikroskopie.
- Sichtbarmachung von sporulierenden und pseudohyphalen Zellen.
- Detaillierte Verteilungsanalyse von Zelltypen innerhalb von Kolonien.
- Neue Erkenntnisse zur Organisation von Pilzgemeinschaften.
Schlussfolgerungen
- Die Einbettungsmethode eignet sich effektiv für die mikroskopische Analyse.
- Sie stellt ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Hefekolonienstruktur dar.
- Zukünftige Forschungsarbeiten können auf dieser Methode aufbauen, um pilzliche Wechselwirkungen zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Das Verständnis der räumlichen Organisation von Zelltypen innerhalb mikrobieller Gemeinschaften unterstützt die Zielvalidierung bei der Entdeckung von antimikrobiellen und antimykotischen Wirkstoffen. Diese Methode ermöglicht eine mechanistische Risikominderung, indem sie phänotypische Heterogenität aufdeckt, die die Wirkstoffantwort und die Entwicklung von Resistenzen beeinflussen kann. Sie liefert eine vorhersagende Sicherheit für Screenings in frühen Entwicklungsstadien, indem sie die Koloniearchitektur mit funktionellen Subpopulationen verknüpft.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die Visualisierung der Verteilung sporulierter und pseudohyphaler Zellen innerhalb von Kolonien.
- Operationaler Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch direkte Beobachtung von Zelltyp-Mustern, die mit funktionellen Zuständen verknüpft sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Arbeitsabläufe vor, indem räumliche Beziehungen zwischen Zelltypen erhalten bleiben.
- Operativer Wert: Verbessert die Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch konsistente Schnittführung und Abbildung der inneren Koloniestrukturen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erläutert die Krankheitsrelevanz durch die Visualisierung eindringender Koloniebereiche, die die mikrobielle Penetration in Wirtsgewebe modellieren.
- Operativer Wert: Beschreibt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem strukturelle Korrelationen mit phänotypischen Ergebnissen ermöglicht werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Platziert die Methode in der frühen Entdeckungsphase bis hin zur Identifizierung von Leitverbindungen, indem sie eine strukturelle Phänotypisierung ermöglicht, die die Entscheidungen für die Verbindungsscreening beeinflusst.
- Entdeckungsbiochemie: Erläutert, wie die Methode die Hypothesenprüfung und Klärung von Signalwegen durch direkte Abbildung asymmetrischer Zellverteilung unterstützt.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft des Assays durch die Herstellung dicker und dünner Schnitte, die mit Licht- und Elektronenmikroskopie kompatibel sind.
- Analytik: Betont quantitative Ergebnisse wie die Frequenzkartierung sporulierender Zellen in verschiedenen Koloniebereichen für vergleichende Analysen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Methode mit der präklinischen Kontinuität, indem invasive Kolonieränder mit Modellen zur Gewebepenetration verknüpft werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt die Methode als wiederverwendbare Fähigkeit für strukturelle Analysen über mehrere Pilzstämme und Bedingungen hinweg dar.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten beim Verhalten mikrobieller Gemeinschaften.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der Koloniepräparation für mikroskopische Analysen mit mehreren Nutzern.
- Strategischer Wert: Bessere Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitalwirksamkeit und verringertes biologisches Risiko in späteren Phasen durch frühzeitige phänotypische Risikominderung.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Weiterentwicklungsentscheidungen basierend auf strukturellen Biomarkern für Virulenz oder Persistenz.
Durchführungsüberlegungen
- Notwendige wissenschaftliche Fachkenntnisse in Histologie, Mikroskopie und Umgang mit Mikroorganismen.
- Erforderliche Instrumentierung und analytische Infrastruktur, einschließlich Mikrotome, Licht- und Elektronenmikroskope sowie Harzinfiltrationssysteme.
- Standardisierungsanforderungen über Teamgrenzen hinweg für Fixierungs-, Färbungs- und Schnittprotokolle zwischen Mikrobiologie- und Bildgebungsteams.
- Anpassungsüberlegungen für verschiedene Modellsysteme, wie biofilmbildende Bakterien oder andere Hefearten mit unterschiedlicher Kolonie-Morphologie.
- Praktische Einschränkungen, die durch die Quellen belegt sind, einschließlich der Größenbeschränkung von Kolonien (1–2 mm Durchmesser) und des mehrtägigen Aufbereitungszeitraums, der sterile Techniken erfordert, um Kontaminationen zu vermeiden.
