Bioenergetische Profil Experiment mit C2C12 Myoblasten Cells

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, den funktionellen Zustand von Mitochondrien in lebenden Zellen und isolierten Mitochondrien zu überprüfen, indem mehrere Parameter des oxidativen Stoffwechsels mit dem XF 96 Extrazellulären Fluss-Analysator gemessen werden. Diese Parameter sind die basale Atmung, die ATP-Umsatzrate, der Protonenleckfluss sowie die maximale Atmung oder die verfügbare respiratorische Kapazität. Dies wird erreicht, indem spezifische Modulatoren der mitochondrialen Atmung nacheinander zu C2C12-Myoblastenzellen hinzugefügt werden, und anschließend die Änderung der Sauerstoffverbrauchsrate, also der OAR, als Indikator der Atmung, sowie die Umwandlung von Glukose zu Lactat, die über die Glykolyse ATP erzeugt, gemessen wird.

Der andere wichtige Energiepfad in Zellen wird ebenfalls als ECAR oder extrazelluläre Säurebildungsrate gemessen. Es können mitochondriale Profilierungsresultate erhalten werden, die Einblicke in die zentrale Rolle geben, die die mitochondriale Funktion bei der Bestimmung der Lebensdauer von Zellen spielt. Hallo, mein Name ist David Nichols.

Ich bin schon mein ganzes Berufsleben lang ein „mitochondrialer Künstler“ gewesen, und das wichtigste Gerät, das ich in meinen Studien verwendet habe, war die Sauerstoffelektrode. Wenn man die Geschwindigkeit der Sauerstoffaufnahme unter verschiedenen Bedingungen mit isolierten Mitochondrien messen kann, erhält man äußerst wichtige Informationen. Wenn man jedoch zu Zellen übergeht, insbesondere zu Zellen, die in einer Mehrfachbrunnenplatte oder auf einem Deckglas kultiviert werden, versagen die klassischen Methoden.

Dies ist ein großes Problem, das vor einigen Jahren durch die Entwicklung eines Mehrmuldenplatten-Assays gelöst wurde, der es uns ermöglicht, die Atmung von Zellen parallel im Format einer Mehrmuldenplatte zu untersuchen. Was Sie heute sehen werden, ist ein sehr einfaches, aber informationsreiches Experiment, das wir entwickelt haben, um die grundlegende mitochondriale bioenergetische Funktion in kultivierten Zellen zu überwachen. Zunächst säen Sie Zellen in XF 96-Zellkulturschalen mit 10.000 Zellen pro Mulde in 100 Mikrolitern Wachstumsmedium und stellen sie in einen 37 °C warmen Inkubator mit 10 % Kohlendioxid.

Die Zellen können 24 Stunden nach der Aussaat im XF 96 analysiert werden, wobei der Assay verwendet wird. Der Assistent erstellt eine Vorlage mit der folgenden Gruppenanordnung. In den Spalten eins bis zwölf befinden sich jeweils 10.000 C zwei C 12-Zellen.

Gruppe eins in Blau dient als Kontrollzellen. Gruppe zwei in Rot erhält die Wirkstoffe Oligo Mycin, FCCP und Roone. Bereiten Sie anschließend die Verbindungen in X-F-D-M-E-M-Assaymedium gemäß des schriftlichen Teils des Protokolls vor.

Oligomycin, FCCP, Rotenon. Diese Verbindungen sind im XF Cell Mito Stress Test Kit vorportioniert enthalten. Ersetzen Sie mit der XF-Probenvorbereitungsstation das Wachstumsmedium durch DMEM-Laufmedium.

Incubieren Sie die Zellen abschließend 60 Minuten lang in einem 37-Grad-Celsius-Inkubator ohne Kohlendioxid, um die Zellen mit dem Assay-Medium vorab zu equilibrieren, bevor die injizierbaren Verbindungen in die Sensorpatrone gegeben werden. Erwärmen Sie die Verbindungen auf 37 Grad Celsius und laden Sie sie anschließend wie folgt in die Injektorports. Für die Spalten eins bis vier geben Sie jeweils 16, 18 und 20 Mikroliter XF-Assay-Medium oder DMEM in die Ports A, B und C.

Für die Spalten fünf bis zwölf pipettieren Sie 16 Mikroliter aller Liga-Mycin in Port A, 18 Mikroliter FCCP in Port B und 20 Mikroliter Rotenon in Port C. Definieren Sie als Nächstes den Protokollbefehl: Schleife auf drei Wiederholungen setzen. Mischen für drei Minuten und Messung für drei Minuten. Klicken Sie danach auf Start.

Befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, die den Benutzer darüber informieren, wann die Kartusche geladen werden muss, nachdem die Kalibrierung abgeschlossen ist. Befolgen Sie die Benutzerhinweise und fügen Sie die Zellplatte für das Experiment hinzu. Klicken Sie anschließend auf „Weiter“ und lassen Sie den Assay laufen.

Entfernen Sie die Platte, wenn das Experiment beendet ist. Dieser Assay leitet sich vom klassischen Experiment zur Charakterisierung der mitochondrialen Funktion ab und dient als Grundlage, um komplexere Experimente aufzubauen, die darauf abzielen, die unterschiedlichen Wirkungen von Verbindungen auf den Zellstoffwechsel, die mitochondriale Funktion und die gesamten bioenergetischen Aktivitäten zu verstehen. Hier beobachteten wir die erwartete Reaktion der Sauerstoffverbrauchsrate, während die Zellen nacheinander mit jeder Verbindung behandelt wurden.

Die ATP-Synthese sank infolge der Blockade der mitochondrialen Komplex-V-Aktivität durch Oligomycin. Da die Zellen nach der Oligomycinbehandlung kein ATP mehr durch oxidative Phosphorylierung synthetisieren konnten, kehrten sie zur Glykolyse zurück, um ihren ATP-Bedarf zu decken. Daher beobachteten wir einen Anstieg der ECAR, der extrazellulären Säuerungsrate, einem Indikator für die Glykolyse, wie zuvor gezeigt. FCCP wirkt als Entkopplungsmittel und beseitigt die Begrenzung des Protonenrückstroms.

Die Atmung beschleunigt sich und ist nun durch den Elektronentransport begrenzt. Schließlich hemmt Rote bekannt Komplex I der Mitochondrien, wodurch der Elektronenfluss in der Atmungskette zum Erliegen kommt und somit der Sauerstoffverbrauch drastisch vermindert wird. Hier erhält man Informationen über die basale Atmung der Zellen, den Prozentsatz des Sauerstoffverbrauchs, der der ATP-Produktion dient, sowie die Menge, die zur Aufrechterhaltung des Protonengradienten aufgrund von Protonenleckage benötigt wird.

Außerdem können wir die maximale respiratorische Rate unter Bedingungen entkoppelter Atmung erhalten, manchmal auch als spare respiratorische Kapazität bezeichnet. Und schließlich können wir die Menge des Sauerstoffverbrauchs bestimmen, die nicht auf mitochondriale Prozesse zurückzuführen ist. Sie haben dies gerade mit dem Seahorse gesehen.

XF 96, eine Versuchsreihe, die umfangreiche Informationen über die bioenergetischen Vorgänge in den Mitochondrien der Zelle liefert. Der grundlegende Versuch, der von so großer Bedeutung ist, den wir Versuch Nummer eins nennen, liefert Daten zur basalen Atmung, zum ATP-Umsatz, zum mitochondrialen Protonenleck und zur verfügbaren respiratorischen Kapazität. Diese Parameter liefern grundlegende Informationen über den bioenergetischen Zustand der Mitochondrien in der Zelle.