Verbesserte Visualisierung und quantitative Analyse von Arzneimittelwirkungen mit mikrostrukturierten Cells

Das allgemeine Ziel des folgenden Verfahrens besteht darin, zu zeigen, wie die Normalisierung der Zellarchitektur und -position, die auf spezifischen adhäsiven Mikromustern erreicht wird, eine einfache Automatisierung der Bildaufnahme und eine unkomplizierte Bildverarbeitung mit empfindlicher und robuster Quantifizierung von Arzneimittelwirkungen ermöglicht, was auf herkömmlichen Glasdeckträgern nicht erreichbar ist. Dies wird erreicht, indem Heli-Zellen auf SI-Zwei-Chips ausgesät werden, die L-förmige, mit SI-Drei markierte Mikromuster tragen. Die Zellen nehmen eine dreieckige Form an und bilden eine Hauptspannungsfasern, die sich über die beiden Enden des L erstreckt. Die gemusterten Zellen werden anschließend mit Lebos-Statins behandelt oder unbehandelt belassen, danach fixiert und angefärbt, um das Aktin-Zytoskelett und die Zellkerne sichtbar zu machen.

Bilder der mikrostrukturierten Zellen werden anschließend aufgenommen und mithilfe des cell ref-Makros zur Erstellung eines Bildstapels für die Analyse sowie des hypotenuse-Makros zur Quantifizierung von Phänotypen verarbeitet. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die einen signifikanten Effekt niedriger Dosen von BLEs Statin auf mikrostrukturierte HELOC-Zellen zeigen, der unter Standardzellkulturbedingungen nicht nachweisbar ist. Hallo, willkommen.

Heute sind wir hier, um Sie Schritt für Schritt durch unseren experimentellen Protokollablauf zu führen, der erklärt, wie adhesive Mikromuster für die Zellanalyse verwendet werden können, und Ihnen zudem experimentelle Daten zeigen, die die einfache Quantifizierung sehr geringer Wirkstoffdosen auf diesen adhesiven Mikromustern veranschaulichen. Wenn Sie diese Mikromuster zum ersten Mal sehen, werden Sie sofort verstehen, wie sie Variabilitätsprobleme bei der Bildaufnahme während der Zellanalyse lösen können. Denn durch ein echtes Zellarray, vergleichbar mit einem Mikroarray, können Sie den Mikroskoptisch einfach von Zelle zu Zelle bewegen, um nacheinander Bilder schrittweise aufzunehmen.

Doch das ist natürlich nicht der einzige Vorteil, den mikroskopische Muster bieten. Sie bringen weitaus mehr Verbesserungen mit sich, da auf bestimmten typischen mikroskopischen Mustern wie dem Kreuzbo oder dem Y die innere Zellarchitektur normalisiert wird. Das bedeutet, dass Organellen, der Spindelapparat, das Cytoskelett und verschiedene Proteinnetzwerke von Zelle zu Zelle an denselben Positionen oder in derselben Ausrichtung vorliegen, wodurch die Wirkung von Wirkstoffen auf diese spezifischen Muster deutlich besser vorhersehbar und quantifizierbar wird. Dies mag im Gegensatz zu dem erscheinen, was üblicherweise in der klassischen Petrischale oder Mikroplatte durchgeführt wird.

Nun, weil man natürlich oft sieht, wie Zellen sich bewegen und unterschiedliche Morphologien annehmen. Auf den adhäsiven Mikromustern hingegen beginnen alle Zellen gleich auszusehen, da sie auf dieses adhäsive Mikromuster reagieren und ihre Architektur auf dieselbe Weise organisieren. Dies mag zwar tatsächlich etwas künstlich erscheinen, aber wenn man genauer hinsieht, ist die Petrischale dann nicht noch künstlicher?

Da in Geweben die Zellen durch benachbarte Zellen sowie durch die extrazelluläre Matrix eingeschränkt sind, erhalten sie sehr viel räumliche Information, die die Zellarchitektur ausrichtet. Und genau diese örtliche Anordnung mittels Mikromustern ist es, was wir tun.

Wir stellen diese räumliche Information in Zellen wieder her, und alle Zellen reagieren darauf und organisieren sich auf dieselbe Weise. Da nun alle Zellen gleich aussehen, können wir das Konzept der Referenzzelle einführen, was bedeutet, dass wir alle Bilder mitteln und ein einzelnes Bild erhalten, das wirklich repräsentativ dafür ist, wie die Zelle unter einer bestimmten Bedingung aussieht. Anschließend können Sie eine Substanz hinzufügen und erneut die Referenzzelle betrachten, um zu sehen, wie sich die Morphologie oder Organisation der Zelle als Reaktion auf diese Substanz verändert hat.

Platzieren Sie zwei Situ Two-Chips einzeln in zwei unabhängige Vertiefungen einer 6-Loch-Platte, wobei sichergestellt werden muss, dass das Situ Two-Logo lesbar ist. Die für dieses Experiment verwendeten Situ Two-Chips weisen Mikromuster auf, die mit FibroGen SI drei gefärbt sind, und sollten vor der Verwendung im Dunkeln aufbewahrt werden. Sammeln Sie Hela-Zellen, die zu etwa 80 % konfluent sind, durch Trypsin und überprüfen Sie mikroskopisch, ob sie ausreichend einzeln vorliegen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 ×g für vier Minuten und resuspendieren Sie sie vorsichtig. Zählen und verdünnen Sie die Zellen auf eine Konzentration von 15.000 Zellen pro Milliliter.

In unvollständigem D-M-E-M-F 12-Kulturmedium 60.000 Zellen pro Vertiefung ansiedeln. Die Platte sollte so wenig wie möglich bewegt werden, um Drehbewegungen im Medium zu vermeiden, die dazu neigen, die Zellen in der Mitte zu konzentrieren. Die Zellen 10 Minuten lang unter dem Abzug sedimentieren lassen, anschließend in den Zellinkubator bringen.

Innerhalb von 10 bis 20 Minuten im Zellinkubator beginnen die Zellen nach 10 Minuten zu adhärieren; überprüfen Sie regelmäßig unter dem Mikroskop, wann die Zellen angeheftet sind. Wechseln Sie das Zellmedium und entfernen Sie überschüssige Zellen, indem Sie den folgenden Vorgang viermal wiederholen. Halten Sie die Platte flach und aspirieren Sie vorsichtig das Medium von der Seite der Vertiefung.

Stellen Sie sicher, dass genügend Medium vorhanden ist, um ein Austrocknen des Chips zu vermeiden. Geben Sie vier Milliliter PBS hinzu und aspirations beginnend in der Mitte des Chips. Bewegen Sie sich dann zur Seite der Vertiefung, um wie zuvor den größten Teil des PBS abzusaugen, und überprüfen Sie unter dem Mikroskop auf schwebende Zellen.

Wenn eine große Menge schwimmender Zellen verbleibt, wiederholen Sie den Waschvorgang. Wenn nur sehr wenige Zellen vorhanden sind, aspirations einen Teil des PBS ab und ersetzen Sie ihn durch zwei Milliliter frisches Medium; aspirations ab und geben Sie zweimal vier Milliliter frisches Medium hinzu. Inkubieren Sie die Zellen drei Stunden lang in einem Zellinkubator, um den Zellen ausreichend Zeit zum vollständigen Ausbreiten zu geben.

Mithilfe dieser Methode werden zwischen 10 und 30 % der Mikromuster von einer einzelnen Zelle besetzt, während andere Muster entweder leer bleiben oder von mehreren Zellen besetzt werden. Um die Zellen mit BLEs-Statin zu behandeln, verdünnen Sie die 17 Millimolar starke Wirkstoff-Stammlösung auf eine Endkonzentration von fünf Mikromolar mit 0,1 % DMSO in vier Milliliter Medium. Für die Kontrolle bereiten Sie Medium mit nur 0,1 % DMSO vor, aspirieren Sie das Zellmedium und ersetzen Sie es schnell durch die BLEs-Statin- oder Kontrolllösungen, um zu verhindern, dass der Chip austrocknet.

Inkubieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Während dieser Inkubation bereiten Sie den Cytoskelettpuffer vor. Geben Sie ein Gramm Saccharose zu zwei Millilitern cb.

Dies hilft, die inneren Zellstrukturen zu erhalten. Mischen Sie ein Milliliter CB-Saccharose mit vier Milliliter 5 % PFA. Geben Sie zwei Milliliter PFA in die CB-Saccharose-Lösung.

In zwei Vertiefungen einer frischen sechswelligen Platte. Zum Fixieren der Zellen den CY2-Chip mit einer Pinzette aufnehmen und in die sechswellige Platte geben, die zwei Milliliter PFA in CB-Saccharose-Lösung enthält. Die Zellen 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, das PFA entfernen und die Zellen einmal mit PBS waschen, anschließend mit zwei Millilitern 100 Millimolar Ammoniumchlorid 10 Minuten lang waschen.

Um die verbleibende PFA-Vernetzungsaktivität abzubrechen, permeabilisieren Sie die Zellen, indem Sie zwei Milliliter PBS mit 0,1 % Tritton X-100 für drei Minuten hinzufügen, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS und färben Sie die Aktinfilamente mit zwei Milliliter ZI-konjugiertem Fain im Verdünnungsverhältnis 1:2000 in PBS mit 1,5 % BSA, inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur. Anschließend waschen Sie die Zellen einmal mit zwei Milliliter PBS. Danach färben Sie die Kerne.

Geben Sie zwei Milliliter einer Ein-Milligramm-pro-Milliliter-Lösung von hawked in PBS hinzu und inkubieren Sie drei Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie zweimal mit je zwei Milliliter PBS. Montieren Sie die beiden Seitenchips mit 25 bis 30 Mikrolitern Montagemedium wie al auf einem Standardobjektträger.

Um Bilder in drei Wellenlängen aufzunehmen, verwenden wir die Metamorph-Bildgebungssoftware und ein NIK icon eclipse T Mikroskop, das mit einer CCD Hema Matsu Kamera und einem Intens lite Quecksilber-Faser-Strahler ausgestattet ist. Wählen Sie zunächst eine 20x-Vergrößerung aus.

Öffnen Sie als Nächstes in der Menüleiste die mehrdimensionale Aufnahme, um die verschiedenen Parameter des Experiments einzurichten. Geben Sie zuerst an, wo Ihre Daten gespeichert werden sollen.

Stellen Sie die Anzahl der Wellenlängen auf drei ein, wählen Sie die SI-Drei-Wellenlängen-Einstellung aus und positionieren Sie den Objektträger so, dass 12 Mikromuster im Kamerafeld zentriert sind. Die Anzahl der pro Feld sichtbaren Mikromuster variiert je nach Kamera- und Objektivkonfiguration. Stellen Sie die Belichtungszeit für jede Wellenlänge ein und aktivieren Sie den Autofokus.

Erstellen Sie für PS drei ein Journal, das eine mehrdimensionale Aufnahme durchführt, und speichern Sie es als MDA jnl. Öffnen Sie die Scan-Stufen-Funktion, um 24 Bilder aufzunehmen, von denen jedes 12 Mikromuster enthält. Geben Sie sechs Spalten und vier Zeilen mit einer x-Schrittweite von minus 400 Mikrometer und einer y-Schrittweite von 300 Mikrometern im Journal-Setup ein, um das Journal MDA jnl hochzuladen; drücken Sie Scan, um die automatisierte Aufnahme der 24 Bilder in den drei Wellenlängen zu starten.

In diesem Video werden L-Mikromuster verwendet, um die Bildung einer einzelnen, großen Aktin-Stressfaser auszulösen, die den nicht angehefteten Teil der Zelle stützt, und um die Visualisierung und Messung der Auswirkungen von Statinen auf Zellen im Vergleich zu Zellen, die auf reiner Fibronectin-Oberfläche sitzen, zu vereinfachen. Für die automatisierte Bildverarbeitung und -analyse stellen wir zwei eigens entwickelte Makros vor, die für das Open-Source-Programm ImageJ geschrieben wurden. Aus einem Stapel roher Bilder extrahiert das erste Makro einzelne Zellen und erzeugt eine Referenzzelle. Das zweite Makro misst den Kollaps der Zellmembran.

Der erste Schritt ist die Segmentierung einzelner Zellen aus Rohbildern. Die fluoreszenzmarkierten Mikromusterbilder werden verwendet, um Bereiche zu begrenzen, die auf die Mikromuster zentriert sind; diese werden in den Bildern für jede Wellenlänge zugeschnitten und zu Stapeln für jede Wellenlänge neu zusammengesetzt. Um Mikromuster mit einzelnen Zellen auszuwählen, erfasst das Makro die Anzahl der Kerne pro Bild und entfernt in allen Stapeln jene, die entweder mehr als einen Kern oder keinen Kern enthalten.

Schließlich wird das Image-J-Plugin Multi-Stack-Reg verwendet, um alle gesammelten Bilder und Kanäle basierend auf der Position des Mikromusters neu auszurichten. Dieser Schritt erzeugt Stapel von Einzelbildern, die nun für die Einzelzellanalyse oder zur Erstellung einer Referenzzelle verwendet werden können. In Image J wird die Referenzzelle durch Projektion der gefilterten und ausgerichteten Bilder aus einem Stapel konstruiert.

Mehrere Projektionsmethoden können angewendet werden, üblicherweise wird jedoch eine Medianprojektion gewählt, um Ausreißer des Bildstapels zu eliminieren. Die Referenzzelle ist ein einzigartiges und nützliches Werkzeug für Darstellung und Bildanalyse, das nur mit mikrostrukturierten Zellen erhältlich ist. Zur Erleichterung ihrer Untersuchung wird eine Farbtabelle (Lookup Table oder LUT) angewendet, um das einfarbige Bild in eine codierte Frequenzkarte umzuwandeln.

Um den Wirkmechanismus von BLEs Statin zu charakterisieren, wurden die Steifigkeit und der Kollaps der Zelle mithilfe eines zweiten J-Makros in ImageJ analysiert. Kurz gesagt, werden Schwellenwert-Bilder des L-Mikromusters verwendet, um die theoretische Hypotenuse der dreieckigen Zellform zu definieren. Anschließend erfolgt die Schwellenwertbestimmung der Aktin-Färbungsbilder, um die Zellform festzulegen.

Die Differenz der Fläche zwischen der theoretischen Hypotenuse und der tatsächlichen konkaven Zellmembran wird dann gemessen; Zellen mit einer Fläche unterhalb der theoretischen Hypotenuse gelten als kollabiert. Die Wirkung von fünf Mikromolar BLEs-Statin wurde durch den Vergleich der Anzahl kollabierter Zellen unter behandelten und Kontrollbedingungen charakterisiert. Typische Bilder von L-mikrostrukturierten Zellen, die mit BLEs-Statin behandelt oder unbehandelt gelassen wurden, sind dargestellt; die Zellen wurden fixiert und angefärbt sowie mikrostrukturiert.

Actin und Kerne sind jeweils in Rot, Grün und Blau dargestellt. Beachten Sie den Einfluss von BLEs Statin auf die Zellform im Vergleich zu Kontrollbedingungen. Hier werden repräsentative Zellen nach Inkubation mit BLEs Statin oder Kontrollen auf unbeschichtetem Fibronectin gezeigt.

Die Zellen wurden fixiert und gefärbt, wobei Aktin und Kerne jeweils grün und blau dargestellt sind. Beachten Sie die Ähnlichkeit zwischen behandelten und kontrollierten Bedingungen. Typische Bilder von Referenzzellen, die aus mit BLEs-Statin behandelten oder unbehandelten Zellen gewonnen wurden, sind dargestellt.

Beachten Sie das Potenzial dieses Ansatzes für die einfache Beobachtung des untersuchten Phänotyps. Hier ist ein Beispiel einer Analyse der Wirkungen von BLEs Statin auf Zellen mithilfe des Makro-Hypotenuse. Während 25 % der Kontrollzellen kollabiert waren, stieg dieser Wert bei den mit fünf Mikromolar BLEs Statin behandelten Zellen dreifach auf 75 % an, was das geschwächte Aktinin-Kontraktionsnetzwerk widerspiegelt.

Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie adhäsive Mikromuster mehrere Engpässe in der Hochdurchsatz-Analyse lösen. Erstens vereinfachen adhäsive Mikromuster die Bildaufnahme, -verarbeitung und -analyse erheblich. Zweitens ermöglichen Mikromuster die Detektion sehr subtiler Wirkungen von Wirkstoffen in sehr niedrigen Dosen, da die Zelle-zu-Zelle-Variabilität reduziert wird, indem Morphologie und Verhalten der Zellen normalisiert werden.

Und schließlich benötigt man im Vergleich zu den Tausenden von Zellen, die normalerweise notwendig sind, um ein gutes Ergebnis in der Zellanalyse zu erzielen, nur einige Dutzend Zellen, um mit unserer Referenzzelle ein robustes und signifikantes Ergebnis zu erhalten.