Subkutane Infektion von Methicillin-resistenten Staphylococcus Aureus (MRSA)

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, das Überleben und die Ausbreitung von methicillinresistenten Staphylococcus aureus sowie die Chemokin- und Zytokinspiegel an den Infektionsstellen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem das Fell von den Rücken der Mäuse entfernt wird, um eine klare Beobachtungsfläche zu schaffen. Als zweiter Schritt.

MRSA in einer Suspension wird drei Tage nach der Infektion subkutan Mäusen verabreicht; Infektionspathologien und Bakterienzahlen können durch die Bestimmung der Anzahl koloniebildender Einheiten aus Gewehomogenaten auf Agarplatten beurteilt werden. Hallo, wie geht es Ihnen? Mein Name ist De Lordon.

Ich bin eine Postforscherin. Hallo, mein Name ist Mariel Sanchez. Ich bin Doktorandin, und ich bin Andrea Huda.

Ich bin ein wissenschaftlicher Mitarbeiter; wir gehören zum Labor von George Lee in der Abteilung für Pädiatrie am Cedar-Sinai Medical Center. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen im medizinischen Bereich zu beantworten, beispielsweise die Modellierung schwerer Infektionen wie Myositis, polymyositis und nekrotisierende Fasziitis. Obwohl diese Methode Einblicke in schwere Notfallinfektionen ermöglicht, kann sie auch auf andere Systeme wie Streptokokken der Gruppe A und andere Organismen angewendet werden.

Außerdem können wir die Funktion und Pathogenese anderer Organismen untersuchen, die Myositis und polymyositis verursachen. Im Allgemeinen haben Personen, die neu bei diesem Verfahren sind, möglicherweise Schwierigkeiten, da einer der Mitarbeiter der Caucus-Bereiche des globalen Regulators stark mutabel ist. Wenn keine Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, können die gesammelten Daten erhebliche Variationen aufweisen, was zu Schwierigkeiten bei der Interpretation der Daten führt.

Beginnen wir. In einer BSL-2-Einrichtung bereiten Sie eine Schafblut-Agarplatte auf TSA-Basis und eine sterile Öse unter Verwendung eines Gefrierrückstands vor. Entnehmen Sie die Stammkultur von Mercer aus der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius.

Verwenden Sie dann mit dem sterilen Öse ein kleines Eisstück der Stammsorte auf die Platte abzubrechen. Nachdem Sie ein kleines Stück der Mercer-Stammsorte gewonnen haben, bringen Sie die Stammsorte unverzüglich zurück in den Gefrierschrank, um ein Auftauen zu vermeiden, da wiederholtes Einfrieren und Auftauen die Stammsorte beschädigen würde. Verwenden Sie die Öse, um den Agar zu beimpfen, um das Wachstum einzelner Mercer-Kolonien zu fördern.

Die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius ohne CO2-Zusatz inkubieren. Am nächsten Tag eine neue Blut-Ei-Schale, eine TSA-Platte und ein 15-Milliliter-Schnappverschlussröhrchen mit drei Millilitern THB vorbereiten und beschriften.

Holen Sie die über Nacht kultivierte M SSA-Platte und untersuchen Sie das hämolytische Phänotyp der Kolonien. Wählen Sie mit einer sterilen Öse eine Kolonie, deren Phänotyp mit den Kolonien früherer Experimente übereinstimmt. Inokulieren Sie das THB mit der ausgewählten Kolonie, indem Sie denselben Strich mit der Öse verwenden.

Die Platte mit der THB-Lösung über Nacht bei 37 Grad Celsius unter Schütteln mit 220 Umdrehungen pro Minute inkubieren. Diese Bakterien werden verwendet, um die Kultur zur subkutanen Infektion der Mäuse in späteren Schritten zu beimpfen. Stellen Sie die Blutagarplatte ebenfalls in den Inkubator.

Die Platte wird am folgenden Morgen verwendet, um zu bestätigen, dass das hämolytische Phänotyp der Bakterien in der THB-Lösung mit dem der ursprünglich ausgewählten Kolonie übereinstimmt. Wenn das Hämolysephänotyp nicht mit dem der ursprünglichen Kolonie übereinstimmt, sollte das Experiment nicht begonnen werden. Übertragen Sie die Maus auf eine Plattform und rasieren Sie das Fell von ihrem Rücken.

Falls das Tier übermäßig aggressiv ist, kann eine Sedierung mit Isofluran notwendig sein. Tragen Sie etwa fünf Kubikmillimeter Haarentfernungsschaum, beispielsweise NA, auf den rasierten Bereich auf. NA ist in der örtlichen Apotheke erhältlich.

Stellen Sie sicher, dass Sie die Haarentfernungscreme mit Babyöl kaufen, da das Produkt ohne Babyöl zu reizend für die Mäuse ist. Lassen Sie die Creme etwa eine Minute lang auf der Hautoberfläche einwirken. Während die Haarentfernungscreme einwirkt, befeuchten Sie nach einer Minute mehrere Papiertücher mit doppelt destilliertem Wasser. Verwenden Sie die feuchten Papiertücher, um den rasierten Bereich sauber abzuwischen.

Stellen Sie sicher, dass die Haut frei von der Haarentfernungscreme ist. Vorgewärmte 10 Milliliter THB in einem 50-Milliliter-Schraubverschlussröhrchen bei 37 Grad Celsius vier bis zehn Stunden lang in einem Bakterieninkubator. Übertragen Sie 20 Mikroliter der Übernachtkultur der Bakterien in das vorgewärmte THB. Dadurch wird die Übernachtkultur verdünnt.

Eine Suspension im Verhältnis 1 zu 500. Inkubieren Sie das Reagenzglas bei 37 Grad Celsius in einem schüttelnden Inkubator mit 220 Umdrehungen pro Minute für etwa zweieinhalb bis drei Stunden. Nach der Inkubationszeit verdünnen Sie die Bakteriensuspension mit zusätzlichem THB auf ein Verhältnis von 1 zu 10 und messen die Suspension mit einem Spektralphotometer.

Bei einer Absorbanz von 514 Nanometern. Inkubieren Sie die Suspension erneut bei 37 Grad Celsius unter Schütteln mit 220 Umdrehungen pro Minute, bis die 1:10-verdünnte Suspension 0,25 erreicht. Um die M er zu sammeln, zentrifugieren Sie das 50-Milliliter-Röhrchen bei 3.225 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie den Pellet.

Suspendieren Sie die Bakterienpalette in 10 Milliliter DPBS und waschen Sie die Bakterien erneut, indem Sie den Zentrifugationsschritt für dieses schwere Infektionsmodell wiederholen. Resuspendieren Sie das Bakterienpellet in etwa einem Milliliter DPBS, was etwa 1 × 10¹⁰ koloniebildende Einheiten pro Milliliter ergibt. Bereiten Sie nacheinander Schafsblut-A-R-T-S-A-Platten vor, verdünnen Sie die Bakterien seriell 10¹- bis 10⁸-fach in DPBS und impfen Sie sie aus.

Tröpfchen von 10 Mikroliter der seriell verdünnten Bakteriensuspension in dreifacher Ausführung auf eine Blutagarplatte auftragen. Die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach einer Inkubation von 16 bis 18 Stunden das Hämolysephänotyp des Inokuls beobachten und dokumentieren.

Zählen Sie die koloniebildenden Einheiten auf den Platten. Die Infektionsinokulation wird basierend auf der Anzahl der koloniebildenden Einheiten auf den Platten berechnet.

Bereiten Sie eine Spritze mit 100 Mikrolitern der zuvor in DPBS hergestellten Bakteriensuspension vor. Vor der Injektion sollten die Mäuse sediert werden, sodass ihre Atemfrequenz etwa einmal pro Sekunde beträgt. Zu Demonstrationszwecken wird in diesem Video eine euthanasierte Maus gezeigt.

Injizieren Sie das M-Serum nach der Injektion in eine Flanke. Bringen Sie die Maus zurück in ihren Käfig. Beobachten Sie die Tiere drei bis fünf Stunden nach der Injektion, um sicherzustellen, dass die Maus lebt, bevor sie zurück in den Tierhaltungsraum gebracht wird.

Überwachen Sie die Läsionen an den Rücken der Tiere täglich, nachdem die Tiere getötet wurden. Messen und dokumentieren Sie Größe und Zustand der Hautläsionen. Sowohl die Bereiche der Haut- als auch der Muskelläsionen werden quantifiziert, indem Länge und Breite der Läsion in Millimetern miteinander multipliziert werden.

Unregelmäßig geformte Läsionen müssen in kleinere symmetrische Abschnitte zerlegt werden, wobei jeder Abschnitt mit derselben Methode vermessen wird. Bereiten Sie 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit jeweils 100 Mikrolitern DPBS für die Gewebesammlung vor. Ritzen Sie die Haut mit einer sterilen Rasierklinge an und schneiden Sie die Läsion mit einer sterilen Schere aus.

Beim Entfernen der Läsion sicherstellen, dass zusätzlich etwa zwei bis fünf Millimeter gesunde Haut um das betroffene Areal herum mit entfernt werden. Die Läsion in die Gewebesammelröhrchen zur Analyse der Muskelläsionen geben. Die Haut vorsichtig abziehen, um die Größe zu messen und den Zustand der Läsion im Muskelgewebe zu dokumentieren.

Entnehmen Sie Milz und Nieren. Legen Sie diese Gewebe in jeweils eigene Sammelgefäße. Homogenisieren Sie die Gewebe durch Schütteln mit einer Ein-Milliliter-Spritze für etwa 30 Sekunden.

Geben Sie 900 Mikroliter DPBS zu jedem Röhrchen hinzu. Bereiten Sie THA-Platten vor und wirbeln Sie die homogenisierten Gewebeproben fünf Minuten lang. Verdünnen Sie die Probe seriell.

Suspensionen werden um den Faktor 10 bis 106 verdünnt. In 96-Well-Platten werden 10 Mikroliter jeder seriell verdünnten Suspension auf die Platten gegeben. Inkubieren Sie die Platten über Nacht in einem Bakterieninkubator bei 37 Grad Celsius.

Am nächsten Morgen die koloniebildenden Einheiten auf den Platten zählen und die Anzahl der koloniebildenden Einheiten anhand der Verdünnungsfaktoren berechnen. Wenn die Infektion korrekt durchgeführt wurde, ist unmittelbar nach der subkutanen Injektion eine Blase an der Hautoberfläche zu beobachten. Wenn keine Blase sichtbar ist, könnte die Injektion zu tief gesetzt worden sein, was das Ergebnis der Infektion beeinträchtigen kann.

Die Läsionsgröße und das bakterielle Überleben können zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion mit MSA bestimmt werden. Die folgenden Hautläsionen wurden am dritten Tag nach der Infektion untersucht und stellen Beispiele für eine Läsion an einer CD1-Maus dar, die an einer Flanke mit einer Konzentration von 1 × 10⁷ koloniebildenden Einheiten infiziert wurde. Muskelläsionen finden sich typischerweise im Gewebe unterhalb der Hautläsionen.

Im Folgenden sind Beispiele für Muskeloberflächenläsionen dargestellt, die mit den zuvor gezeigten Hautläsionsfotos übereinstimmen. Dabei handelt es sich um Muskelveränderungen, die am dritten Tag nach der Infektion bei einer mit einer Million (1 × 10⁷) koloniebildenden Einheiten infizierten Maus beobachtet wurden. Die Läsionsfläche ergibt sich aus der Länge multipliziert mit der Breite der Läsion, gemessen in Millimetern, und kann zur Beurteilung des Hautgewebeschadens herangezogen werden.

Die Anzahl der koloniebildenden Einheiten der Bakterien, die an der Infektionsstelle lokalisiert sind, kann an exzidierten Läsionen quantifiziert werden. Die Zählung der koloniebildenden Einheiten kann anzeigen, ob ein Virulenzfaktor dem MSA einen Überlebensvorteil verleiht. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist darauf zu achten, aufgrund der Verwendung von Nadeln und hochpathogener Mikroben die üblichen Sicherheitsvorkehrungen zu beachten.

Als letztes verwendet das Abszessmodell eine 1.000-fach geringere Inokulationsmenge im Vergleich zu unserem Modell und kann verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise welche Faktoren von S eine anhaltende RSA-Infektion fördern. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit einer Spritze, die mit einem Mars A gefüllt ist, äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie das direkte Entsorgen der Spritze in einen spitzenfesten Behälter wichtig sind, um versehentliche Stichverletzungen durch die Nadel zu vermeiden. Außerdem ist es für dieses Experiment wichtig, die standardmäßigen BSO2-Protokolle einzuhalten, um eine ordnungsgemäße Desinfektion des Arbeitsbereichs sicherzustellen.

Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen. Hallo. Hallo, tschüss.