Sammeln Variable-Konzentration Isotherme Titrationskalorimetrie Datasets in Auftrag, um bindende Mechanismen bestimmen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das korrekte physikalische Modell für die Bindung eines Makromoleküls an seinen Liganden zu identifizieren und die damit verbundenen thermodynamischen Parameter zu bestimmen. Dies wird erreicht, indem zunächst durch umfassende Dialyse eine Stammlösung des Makromoleküls hergestellt wird. Der gewünschte Ligand wird anschließend im Enddialysuffer gelöst, und in einem zweiten Schritt werden die Konzentrationen aller Komponenten bestimmt.

Die Makromolekül- und Ligandenproben werden sorgfältig auf eine Reihe unterschiedlicher Konzentrationen verdünnt. Anschließend wird eine Reihe von isothermen Titrationskalorimetrie-Experimenten (ITC) bei mehreren Konzentrationen sowohl des Liganden als auch des Proteins durchgeführt, um im letzten Schritt des Verfahrens eine Reihe von ITC-Isothermen zu erhalten. Die globale Analyse der Versuchsreihe erfolgt unter Verwendung verschiedener physikalischer Modelle, wobei das Modell mit der besten Gesamtübereinstimmung als korrekt identifiziert wird.

Heute werde ich Ihnen eine Methode vorstellen, die dabei helfen kann, biophysikalische Fragen zu beantworten, beispielsweise wie Proteinmoleküle ihre Liganden binden, und die genaue Maße für Bindungsparameter wie Entropie, Enthalpie und Assoziationskonstanten liefern kann. Vor Beginn dieses Protokolls reinigen Sie das Protein der Untersuchung; das Makromolekül, das in dieser Demonstration verwendet wird, ist ein Immuno-GLYCOSID N sechs prim, ein Substrattransferase ein I oder ein C sechs prim ein I. Zunächst bereiten Sie vier Liter Dialysepuffer vor und kühlen diesen auf vier Grad Celsius. Danach dialysieren Sie ein kleines Volumen einer Makromolekül-Lösung.

In diesem Fall fünf Milliliter 400 µM AAC C sechs Strich, ein Auge in 1,3 Liter Dialysepuffer bei vier Grad Celsius. Dies kann in einem Kühlschrank oder Kühlraum durchgeführt werden, wobei alle acht Stunden ein Pufferwechsel erfolgt und insgesamt dreimal dialysiert wird. Bewahren Sie die endgültige Dialyselösung auf.

Filtern Sie 750 Milliliter der endgültigen Dialyselösung durch einen 0,45-Mikron-Cellulosefilter und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius. Dieser Puffer, der nun als Laufpuffer bezeichnet wird, wird für Spülvorgänge und als Verdünnungsmittel verwendet. Für die Proben spülen Sie einen 0,2-Mikron-Spritzenfilter gründlich mit Laufpuffer aus.

Das Proteinsample auftragen und filtrieren. Die Probe vorsichtig in einem kegelförmigen Reagenzglas sammeln, bevor die Proteiniösung gelagert wird, und die Proteinmenge mit einem standardisierten Protein-Assay bestimmen. In diesem Fall wird die Proteinmenge durch die ABSORBANZ bei 280 Nanometern gemessen und die Enzymkonzentration berechnet.

Unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten, der vom EXI-Proteomik-Server generiert wurde, das Protein so lagern, dass die Langzeitstabilität maximiert wird. AAC C sechs prim ein i muss bei vier Grad Celsius gelagert werden, da es nach Einfrieren und Auftauen keine Aktivität mehr aufweist. Als Nächstes den Liganden und Puffer für den Durchlauf lösen. Für diese Demonstration wurden vier Milligramm Acetyl-Coenzym A in 200 Mikrolitern Puffer für den Durchlauf gelöst, um eine 25 Millimolar Stammlösung herzustellen.

Dieses Ligand kann bis zur Verwendung zur Herstellung der ITC-Proben bei minus 78 Grad Celsius aufbewahrt werden. Zunächst berechnen Sie die Enzymkonzentration, um einen C-Wert von 64 zu erhalten, wie in der schriftlichen Anleitung für AAC sechs Strich eins I beschrieben. Dies entspricht einer Konzentration von 192 Mikromolar. Bereiten Sie eine zwei Milliliter große Lösung des Makromoleküls in dieser Konzentration vor, indem Sie die Stammlösung mit dem filtrierten Puffer für den Durchlauf FIA verdünnen. Tauen Sie das Acetyl-Coenzym-A in einem Eiswasserbad auf. Sobald die Acetyl-Coenzym-A-Lösung aufgetaut ist, mischen Sie sie vorsichtig und berechnen Sie die Konzentration der Ligandlösung, indem Sie die Makromolekülkonzentration mit der Anzahl der Bindungsstellen multipliziert mit 10 multiplizieren.

Bereiten Sie die Acetyl-Coenzym-A-Lösung vor, indem Sie 80 Mikroliter der 25 Millimolaren ACE-Coenzym-A-Stammlösung zu 420 Mikrolitern Puffer hinzufügen und mischen. Überführen Sie die verdünnte Acetyl-Coenzym-ACE-Lösung in ein Pipettenfüllrohr und lagern Sie die verbleibende 25-Millimolar-Stammlösung bei minus 78 Grad Celsius. Entgasen Sie die A-C-sechs-prim-Eins-A und die subtile Coenzym-A-Lösungen unter Vakuum für fünf Minuten bei 19 Grad Celsius, was einen Grad Celsius unter der gewünschten experimentellen Versuchstemperatur liegt.

Um die Injektionsspritze einzurichten, führen Sie die Spritze durch einen Spritzenhalter, bis die vormontierte Spritzenklemme auf gleicher Höhe mit dem Halter ist. Führen Sie die zweite Spritzenklemme über die Injektionsspritze, bis sie fest an der Unterseite des Spritzenhalters anliegt. Ziehen Sie die Klemme vorsichtig mit dem beigefügten 0,05-Zoll-Kugelend-Inbusschlüssel an.

Als Nächstes setzen Sie den Spritzenhalter in den Pipettenhalter ein. Führen Sie vorsichtig die Pipetteninjektionsspritze in die Injektionsspritze ein, und stellen Sie sicher, dass die Kolben Spitze direkt in die Öffnung der Spritze eingeschoben wird. Sobald die Spritze vollständig eingeführt ist, schrauben Sie die Verriegelungsmutter des Spritzenhalters in die Pipetteninjektionsspritze hinein.

Bevor die A a C six prime one eye Proteinstichprobenlösung geladen wird, spülen Sie die Probenzelle mit dem mit dem Gerät bereitgestellten Zellenspülsystem mit mindestens 50 Milliliter Laufpuffer. Entfernen Sie den restlichen Puffer aus der Probenzelle durch Absaugen mit einer langen Nadel und einer 2,5-Milliliter-Glaskolben-Spritze. Entfernen Sie die Lösungen aus dem Entgasungsvakuum mithilfe einer zweiten sauberen, trockenen langen Nadel.

2,5-Milliliter-Spritze. Ziehen Sie vorsichtig mindestens 1,8 Milliliter der A a C six prime one eye-Probe in die Spritze auf. Achten Sie darauf, Luftblasen zu vermeiden.

Nachdem die Spritze mit der Proteinprobe beladen wurde, setzen Sie die Nadel in die Probenkammer ein und berühren Sie vorsichtig den Boden der Kammer. Heben Sie die Nadel um etwa einen Millimeter an und injizieren Sie die Probe vorsichtig in die Kammer, bis überschüssige Flüssigkeit über dem oberen Rand der Probenkammer sichtbar ist. Um eingeschlossene Luftblasen aus der Kammer zu entfernen, heben Sie die Nadel um etwa einen Zentimeter an, während Sie sicherstellen, dass weiterhin Lösung im Überlauf vorhanden bleibt, und ziehen Sie dann schnell etwa 0,25 Milliliter der Lösung zurück, bevor Sie sie erneut injizieren.

Schieben Sie nun die Nadel vorsichtig entlang der Seite des Überlaufs nach oben. In der Probenmulde stößt die Nadel auf eine Stufe. Ziehen Sie die gesamte Flüssigkeit oberhalb dieser Stufe ab, da die Stufe die gewünschte Höhe für die Laufpufferlösung anzeigt.

Um die Injektionsspritze zu befüllen, befestigen Sie die Kunststoffschläuche-Blähvorrichtung am Befüllanschluss und senken Sie den Spritzenstößel bis zum oberen Ende des Befüllanschlusses ab. Stellen Sie nun das Pipettenfüllrohr mit der DGA-Ligandenlösung auf den Boden des Pipettenhalters. Prüfen Sie, dass die Spritzenkanüle das untere Ende des Füllrohrs nicht berührt, und ziehen Sie die Lösung langsam in die Spritze, bis eine geringe Menge in das Rohr der Befüllspritze eindringt.

Als Nächstes schließen Sie den Füllanschluss, indem Sie die Kolben Spitze absenken. Dies erfolgt durch Klicken auf die Schaltfläche „Füllanschluss schließen“. Anschließend entfernen Sie eventuell beim Beladen eingeschlossene Luftblasen.

Spülen und erneut befüllen Sie durch Klicken auf die Spülbefüll-Schaltfläche. Wiederholen Sie den Vorgang insgesamt dreimal. Sobald der Spülbefüll-Vorgang abgeschlossen ist, nehmen Sie das Befüllrohr aus dem Pipettenhalter und wischen Sie die Spritzen Spitze vorsichtig mit Labor-Kreppapier ab.

Senken Sie nun die Spritze der Pipettierhilfe vorsichtig in die Probe ab. Gehen Sie behutsam vor, da die Nadel leicht verbiegen kann. Stellen Sie sicher, dass die Spritze vollständig eingeführt ist, indem Sie auf den Boden des Verriegelungskolbens drücken.

Nachdem die Spritze befestigt ist, stellen Sie die gewünschte Betriebstemperatur ein und wählen Sie eine Referenzleistung, die geringfügig höher liegt als der erwartete maximale Wärmestrom während der Injektion. In diesem Beispiel werden 20 Grad Celsius und 20 Mikrokilokalorien pro Sekunde als Betriebstemperatur bzw. Referenzleistung verwendet. Anschließend programmieren Sie die gewünschten Injektionsvolumina und Verzögerungen.

Hier werden 28 Injektionen verwendet, wobei die erste ein Volumen von zwei Mikrolitern und eine Verzögerung von 62 Sekunden aufweist, während die nachfolgenden Injektionen ein Volumen von 10 Mikrolitern und Verzögerungen von 332 Sekunden haben. Das hier dargestellte Experiment liefert die Grundlage, um einen Datensatz bei einer einzelnen Konzentration zu erzeugen, um die zusätzlichen Kurven zu generieren, die erforderlich sind. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit abnehmenden Makromolekül- und Ligandenkonzentrationen.

Stellen Sie sicher, dass alle Makromolekül- und Ligandproben aus derselben Stammlösung stammen, um Fehler in den Konzentrationen zu minimieren. Hier ist die rohe isotherme Titrationskalorimetrie-Kurve dargestellt, die durch die Titration von 3,86 Millimolar Ligand Acetyl-Coenzym A in 192 Mikromolar des Mikromoleküls erzeugt wurde. A A C sechs Strich eins.

Die integrierten Werte des Auges wurden verwendet, um die Bindungsparameter mittels einer sequenziellen Zwei-Stellen-Anpassung zu bestimmen. Dieses Diagramm zeigt die durch ITC erzeugten Isothermen bei variierenden Konzentrationen von ACE-Coenzym A und AAC C sechs Prime One Eye. Die experimentellen Daten, dargestellt durch offene Kreise, wurden sowohl an ein unabhängiges Modell mit zwei Sätzen von Bindungsstellen als auch an ein sequenzielles Zwei-Stellen-Modell angepasst.

Eine bessere Übereinstimmung zeigt sich mit dem zweistufigen sequenziellen Modell. Die verwendeten Protein-konzentrationen sind im begleitenden Text definiert. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, sehr genau zu verdünnen, da Änderungen der Konzentrationen drastische Auswirkungen auf die Ergebnisse haben können.