Genotypische Inference von HIV-1 Tropismus mit Populations-basierte Sequenzierung von V3

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die virale Tropismus bei einem HIV-infizierten Patienten durch Sequenzierung der V3-Region des viralen Hüllproteingens zu bestimmen, um zunächst H-I-V-R-N-A aus dem Blutplasma des Patienten zu extrahieren. Anschließend wird die V3-Region von HIV GP 120 mittels nested R-T-P-C-R amplifiziert. Danach wird das Vorhandensein des Amplifikats mittels Gelelektrophorese überprüft, gefolgt von einer populationsbasierten Sequenzierung der amplifizierten V3-Produkte.

Analysieren Sie abschließend die Sequenzen mithilfe einer Basenaufruf-Software und schließen Sie anhand des Genoms auf die Cofaktor-Nutzung unter Verwendung des Genom-zu-Phänotyp-Algorithmus. Letztendlich können diese Ergebnisse zeigen, ob die virale Tropismusform eines Patienten R5- oder nicht-R5-typisch ist, durch eine populationsbasierte Sequenzierung der HIV-V3-Schleife. Der primäre Vorteil dieses Verfahrens gegenüber bestehenden Methoden wie phänotypischen, zellbasierten Assays liegt daher darin, dass es in jedem Labor durchgeführt werden kann, das über eine Sequenzierungsapparatur verfügt, und zwar zu geringeren Kosten, in kürzerer Zeit und mit geringerem Ausgangsmaterial.

Diese Technik ist im Hinblick auf die Behandlung mit einer antiretroviralen Therapie relevant, da sie bestimmen kann, ob die virale Population eines Patienten wahrscheinlich auf einen CCR5-Antagonisten anspricht. Aus 500 Mikrolitern Plasma unter Verwendung eines Easy Mag-Automatenextraktors die HIV-RNA extrahieren. Danach in einen PCR-reinen Raum wechseln, um die RT-PCR einzurichten, um eine ausreichende Abtastung der viralen Population sicherzustellen.

Planen Sie, jede Reverse-Transkriptionsreaktion in diesem Ein-Schritt-Verfahren verdreifacht durchzuführen. Verwenden Sie virale RNA, um cDNA zu synthetisieren, wobei spezifisch der HIVV-drei-Bereich mit SQV drei F1 und CO 6 0 2 Prime-Reparatur amplifiziert wird. Basierend auf den Komponenten pro Reaktion.

Stellen Sie eine Stammlösung in ausreichender Menge für die Anzahl der zu amplifizierenden Proben mithilfe einer Mehrkanalpipette her. Geben Sie 36 Mikroliter der Probenmischung in jedes Loch der PCR-Platte. Wechseln Sie nun zur Mehrkanalpipette, um Mikroliter der RNA-Probenextraktlösung in die jeweils vorgesehenen Löcher umzusetzen. Achten Sie darauf, zwischen jeder Zugabe die Pipettenspitzen zu wechseln.

Nach Abschluss des Transfers die Vertiefungen mit PCR-Streifenkappen verschließen. Anschließend die PCR-Platte in einen Thermocycler geben, der für eine einstufige R-T-PCR der HIVV-drei-Region programmiert ist. Für die nested PCR verwenden Sie das SQV-drei-F-zwei- und das CD-vier-R-Primer-Reparaturset.

Berechnen Sie die Menge an Reagenz, die für die Anzahl der Proben erforderlich ist, die in einem PCR-Reinraum amplifiziert werden sollen. Stellen Sie die nested PCR-Mischung her und aliquotieren Sie dann mithilfe einer Mehrfachpipette je 19 µL pro Vertiefung einer sauberen PCR-Platte. Nach Abschluss der R-T-P-C-R wechseln Sie in einen Bereich nach der Amplifikation.

Verwenden Sie eine achtkanalige Mehrkanalpipette, um einen Mikroliter der R-T-P-C-R-Vorlage in die nested PCR-Mischung zu übertragen. Wechseln Sie die Spitzen nach jeder Zugabe. Verschließen Sie die Vertiefungen mit PCR-Streifenkappen und bringen Sie die Platte zur Amplifikation in einen Thermocycler.

Entfernen Sie die Platte vom Thermocycler, nachdem die Temperatur auf 25 Grad Celsius zurückgekehrt ist. Um zu bestätigen, dass die V-drei-Region erfolgreich amplifiziert wurde, analysieren Sie die Produkte zunächst mittels Gelelektrophorese. Bereiten Sie ein 1,6 %iges Agarosegel mit Cyber-Safe-Gelfärbemittel vor.

Unter Verwendung einer 10-Mikroliter-Multikanalpipette übertragen Sie acht Mikroliter PCR-Proben in die jeweiligen Vertiefungen. Laden Sie außerdem einen DNA-Längenstandard in mindestens eine Vertiefung pro Reihe.

Laufen Sie das Gel etwa 10 Minuten lang bei 100 Volt. Sichtbaren Sie die Banden mittels UV-Fluoreszenz und dokumentieren Sie das Bild durch Fotografie. Notieren Sie die Proben, bei denen alle dreifachen Amplifikationen erfolgreich waren.

Falls erforderlich, wiederholen Sie die RT-PCR für die Proben mit weniger als drei Produktverstärkungen. Die amplifizierten viralen cDNA-Proben werden weiter durch DNA-Sequenzierungsreaktionen verifiziert, die mit den Primern V 3 0 2 F und S QV drei R eins durchgeführt werden. Entfernen Sie das große Di-Reagenz aus dem Gefrierschrank und lassen Sie es bei Raumtemperatur auftauen.

Berechnen und bereiten Sie die Reagenzien vor, die für die Anzahl der durchzuführenden Proben erforderlich sind. Portionieren Sie mit einer Mehrkanalpipette jeweils fünf Mikroliter Sequenzierreaktionsmix in die entsprechenden Plattenmulden. Bedecken Sie die Platte mit einem Kim-Tuch und stellen Sie sie beiseite.

Unterdessen bereiten Sie eine 1:15-Verdünnung des amplifizierten PCR-Produkts vor, indem Sie 180 Mikroliter sterilem Wasser zum verbleibenden PCR-Produkt hinzufügen. Pipettieren Sie ein Mikroliter der verdünnten Probe auf den Boden der entsprechenden Vertiefung. Wechseln Sie nach Abschluss der Probenübertragung stets die Pipettenspitzen zwischen den Proben.

Versiegeln Sie die Platte mit Streifendeckeln und wirbeln Sie sie eine Sekunde lang. Um die Platte zu zentrifugieren, stellen Sie die Drehzahl auf 140 5G ein. Sobald die Drehzahl 140 5G erreicht hat, stoppen Sie die Zentrifugation.

Stellen Sie die Platte in einen Thermocycler, damit die Reaktion ablaufen kann. Fällen Sie in jedem Wells die DNA mit vier Mikrolitern dreimolarer Natriumacetatlösung und 40 Mikrolitern gekühltem 95%igen Ethanol und verschließen Sie die Deckel erneut. Zentrifugieren Sie die Platte 10 Sekunden lang und klopfen Sie leicht auf die Platte, um eventuelle Luftblasen zu lösen.

Stellen Sie die Platten zwischen 30 Minuten und zwei Stunden lang bei minus 20 Grad Celsius ab. Gewinnen Sie die DNA durch Zentrifugation bei 2000 ×g für 20 Minuten. Entfernen und entsorgen Sie die Streifendeckel.

Drehen Sie die Platte über dem Abfallbehälter um und gießen Sie das Überstandsmittel ab. Entfernen Sie jegliches verbleibende Überstandsmittel, indem Sie die umgedrehten Platten auf ein Papiertuch tupfen.

Falten Sie zwei Blatt Papiertuch, um die Platte einzuschließen. Legen Sie die Platte mit der Oberseite nach unten in die Zentrifuge und zentrifugieren Sie bei 140 5G. Stoppen Sie die Zentrifugation, wenn 140 5G erreicht sind.

Anschließend mit 155 Mikrolitern 95%igem Ethanol waschen und abgießen. Danach die Zentrifugation wiederholen. Das Plättchen zwei bis fünf Minuten stehen lassen, damit der restliche Ethanol verdunsten kann.

Um die DNA-Proben zu denaturieren, verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 10 Mikroliter Farbstoff mit hoher Dichte in alle Vertiefungen der Platte zu geben, einschließlich der leeren. Versiegeln Sie die Platte mit einem Septum und geben Sie sie für zwei Minuten in einen Thermocycler bei 90 Grad Celsius. Schließlich bringen Sie die Probenplatte in eine Sequenzierungsplatte und anschließend in den Sequenzierer.

Ein akzeptabler Weg zur Datenanalyse ist die Verwendung der Software Recall, um eine automatische Basenidentifizierung ohne menschliches Eingreifen durchzuführen. Recall ist eine kostenlose, benutzerdefinierte Aufrufsoftware. Melden Sie sich an und wählen Sie mit der Durchsuchen-Option die hochzuladenden Beispieldateien aus. Suchen Sie die Rohsequenzierungsdatendatei und laden Sie bis zu 20 Megabyte hoch.

Als Nächstes stellen Sie die Referenzsequenz auf V drei ein. Klicken Sie auf Daten verarbeiten. Wählen Sie den resultierenden Ordner auf der rechten Seite der Seite aus, um die Liste der Proben anzuzeigen.

Diejenigen, die rot sind, haben die Prüfung nicht bestanden. Diejenigen, die grün sind, haben die Prüfung bestanden. Durch Klicken auf eine bestimmte Probe und den Ansicht-Button können Sie die Sequenz überprüfen, die Anweisungen auf der rechten Seite der Seite befolgen, um sich durch die Sequenz zu navigieren, und Dateien in einen Zip-Ordner herunterladen.

Die virale Tropismus kann aus Sequenzen abgeleitet werden, die mittels populationsbasierter Sequenzierung unter Verwendung des Geno-Pheno-Kokrezeptor-Algorithmus generiert wurden. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü der signifikanten Einstellungen die Optimierung basierend auf der Analyse klinischer Daten aus MOTIVATE 2 % und 5,75 % FPR. Wählen Sie nun, ob eine Sequenz zum Analysieren hochgeladen oder eingefügt werden soll.

FASTA-Dateien sind akzeptabel. Fahren Sie nicht fort, um einen Geno Tono FPRA-Prädiktor für die Ansprechbarkeit auf CCR-fünf-Antagonisten zu erhalten. Der erstellte G-two-P-Bericht liefert die V-drei-Schleifensequenz in Aminosäuren und zeigt relevante Positionen von Mutationen an, die mit nicht-R-fünf-verwendendem Virus assoziiert sind.

Am Ende des Berichts wird die Falsch-positiv-Rate angegeben und im Hinblick auf die Reaktion auf einen CCR5-Antagonisten interpretiert. Dieser Bericht kann als PDF-Datei heruntergeladen werden. Wenn bei einer der drei Sequenzen einer Probe geschlussfolgert wird, dass sie nicht R5 ist, wird der Patient voraussichtlich nicht wie erwartet auf einen CCR5-Antagonisten ansprechen. Die Gelelektrophorese von RT-PCR-Amplifikationen der HIV-1-V3-Schleife zeigt, dass nicht alle klinischen Proben ein Produkt ergeben.

Die erzeugten Sequenzen aus den amplifizierten Proben können in einem Chromatogramm durch Rückabfrage visualisiert werden. Es wird eine saubere Sequenz mit wenigen Mischungen erwartet. Gelegentlich können die Sequenzen unübersichtlich sein und einer genauen Basenzuordnung nicht zugänglich.

Bei einigen Patienten kann festgestellt werden, dass sie einen Virus haben, der nicht über CCR5 verfügt, wie hier gezeigt. Diese Patienten werden wahrscheinlich nicht auf eine Behandlung mit einem CCR5-Antagonisten ansprechen. Die Mehrheit der Patienten weist jedoch eine virale Population auf, die aus dem über CCR5 verfügbaren Virus besteht, wie durch ein grünes Kästchen am unteren Rand des G2P-Analyseberichts angegeben.

Wenn diese Technik einmal beherrscht ist, kann sie von Anfang bis Ende in etwa vier Tagen durchgeführt werden – von der Extraktion bis zur Analyse. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die virale Tropismusvorhersage mithilfe populationsbasierter Sequenzierungsverfahren in Kombination mit dem genomischen Phäno-Bioinformatik-Algorithmus erfolgt.

So, das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.