Murine Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation

Hallo, ich bin Greg Zott. Ich arbeite am UCSF Diabetes Center im Bluestone-Labor, und heute zeige ich Ihnen das Verfahren zur Isolierung von Mausinseln. Das Verfahren umfasst die Injektion einer Kollagenase-Lösung in die Bauchspeicheldrüse einer C3H-Donormaus, woraufhin wir die Bauchspeicheldrüse entnehmen, sie enzymatisch aufspalten, die Inseln über ein Dichtegradientenverfahren reinigen und anschließend per Hand auswählen, um sie letztendlich unter die Nierenkapsel einer diabetischen NOD-Maus – unserem Empfänger – zu transplantieren.

Bevor wir mit diesem Verfahren beginnen, haben wir unsere ATE-Lösung in einem modifizierten Hanks-Puffer verdünnt und die Konzentration spezifisch für den Mäusestamm C3H angepasst. Wir haben festgestellt, dass die Verdauung mit einer Kollagenase-Lösung von 0,8 mg pro ml besser funktioniert, und werden diese verwenden, um sie in den Ductus choledochus zu injizieren, um die Bauchspeicheldrüse aufzudehnen. Den Eingriff wird heute Pavo Codre vom Diabeteszentrum durchführen. Er wird die Maus öffnen, die Därme freilegen und anschließend in den Ductus choledochus injizieren.

Wir werden die Maus mit Ethanol besprühen, um das Fell glatt zu halten, und anschließend überprüfen, ob die Maus korrekt getötet wurde, indem wir eine Zehe kneifen. Pavo wird nun die Maus eröffnen und mittels einer medianen Inzision den Darm und die Bauchspeicheldrüse freilegen. Außerdem wird das Zwerchfell durchtrennt, um sicherzustellen, dass die Maus getötet wurde.

Bevor wir beginnen, möchte ich auf einige der wichtigen Strukturen hinweisen. Der Magen liegt genau hier, wobei die Bauchspeicheldrüse darunter mit dem Zwölffingerdarm verbunden ist. Dies ist die Leber, in der wir die Gallenblase und den Ductus choledochus finden, den Sie genau hier sehen können.

Als Nächstes wird Pavo den Dünndarm isolieren und die Stelle finden, an der der Ductus choledochus in den Dünndarm mündet. Sobald der Darm freigelegt ist, klemmen wir mit Moskitoklammern auf beiden Seiten des Ductus choledochus ab. Wir stellen fest, dass dies ermöglicht, dass mehr Kollagenasen in die Bauchspeicheldrüse gelangen, während andere Gruppen versuchen, die Klammer direkt über dem Ductus choledochus anzubringen.

Wir stellen fest, dass diese Technik eine bessere Durchlässigkeit des Enzyms in den Pankreas ermöglicht. Dies ist ein schonendes Verfahren. Sie sollten den Darm nicht verletzen.

Sie sollten die Klammern sanft auf beiden Seiten des Ductus choledochus liegen lassen. Nun werden wir eine Gallenblase finden, und sobald die Gallenblase freigelegt ist, nutzen wir sie als Orientierungshilfe, um die Kollagenase in den Ductus choledochus zu injizieren. Powell verwendet eine Nadel mit 30 Gauge und eine Fünf-cc-Spritze, die drei Milliliter Kollagenase-Lösung enthält.

Während er in den Ductus choledochus eindringt, dehnt er diesen mit Kollagenase-Lösung aus und bewegt sich dann entlang des Ductus choledochus, bis er nahe dem Darm angekommen ist. Während er sich vorwärts bewegt, wird die Enzymlösung in die Bauchspeicheldrüse gepumpt. Nun, da die Bauchspeicheldrüse mit Kollagenase-Lösung aufgebläht ist, wird Powell die Hämostasen entfernen und anschließend die Bauchspeicheldrüse vorsichtig vom Darm lösen und aus der Maus entnehmen.

Er entfernt es aus dem Magen. Gut, und dann benutzt er die Milz als Griff, hebt die Bauchspeicheldrüse an und trennt sie langsam im Bereich des Ductus choledochus ab, das war's. Die Bauchspeicheldrüse wird ausgebreitet, anschließend wird die Milz entfernt, und dort entfernt er das mesenterische Gewebe. Danach wird die Bauchspeicheldrüse in eine zwei Milliliter umfassende Kollagenase-Lösung gegeben und in ein sterilisiertes Glasröhrchen überführt, das anschließend wieder auf Eis gestellt wird.

Das isolierte Pankreas, das wir in die Glasgefäße gegeben haben, wird nun für etwa 17 Minuten in ein 37 °C warmes Wasserbad gestellt. Wir haben sie in ein 50 ml konisches Röhrchen gestellt, damit sie nicht nach oben aufsteigen. Sobald das Wasserbad beginnt, startet die Zeitschaltuhr und die Verdauung setzt ein.

Nach Beendigung der Verdauungszeit werden die Gefäße entnommen, vorsichtig geschüttelt und aufgelöst. Sobald das Gewebe zu zerfallen beginnt, wird das Gefäß anschließend auf Eis gestellt. Ein steriler Sieb wird über einen 400 ml-Becher gelegt, der Waschpuffer enthält.

Der Pankreas-Digester wird anschließend vorsichtig über das Sieb in den Waschpuffer gegossen. Zu Demonstrationszwecken wurde die Abzugshaube ausgeschaltet und die Glasscheibe der Haube angehoben, damit wir sehen können, was wir tun. Sobald der Pankreas-Digester in den Becher gegossen ist, werden die Gefäße mit dem gleichen Waschpuffer gespült und der Waschpuffer über das Sieb gegeben.

Wir haben eine Spritze, die mit Waschpuffer gefüllt ist. Damit werden wir das Gewebe kräftig durch das Sieb spülen. Ziel ist es, alle losen Ösen freizusetzen, die nicht an der Matrix befestigt sind, während die Membranen und das undigestierte Gewebe auf dem Sieb verbleiben.

Und wenn Sie die Wäsche eines Gewebes abgeschlossen haben, sieht das am Ende des Verfahrens normalerweise so aus. Das Pankreasgewebe, das sich am Boden des Röhrchens befindet, wird nun auf zwei 50-ml-Konischgefäße verteilt, das Gewebe wird gewaschen, gleichmäßig vermischt und anschließend gleichmäßig verteilt, sodass wir in jedem Röhrchen ein gleiches Pelletvolumen erhalten. Der Becher wird nun mit weiterem Waschpuffer ausgespült.

Die Seiten werden gespült, um das gesamte Gewebe, das in den Becher gelangt ist, erneut aufzunehmen. Anschließend wird es gleichmäßig auf zwei 50-mL-Konische verteilt. Diese werden dann mit Waschpuffer aufgefüllt.

Das Gewebe wird mehrmals umgestülpt und anschließend in eine Zentrifuge gegeben. Es erfolgt ein kurzer Zentrifugationsschritt. Die Zentrifuge darf bis zu 1.000 U/min erreichen und wird danach ausgeschaltet.

Das Gewebe ist zu diesem Zeitpunkt sehr empfindlich, und Sie sollten es nicht zu stark verdichten. Die Röhrchen werden entfernt, und wir werden diesen Waschschritt noch dreimal durchführen. Hiermit ist der dritte Waschschritt beendet.

Die Bestandteile des 50-ml-Kegelrohrs werden in das 15-ml-Kegelrohr überführt und bei tausend U/min zentrifugiert, dann angehalten. Der Überstand wird entfernt, und der erste Teil des FI Call wird gestartet. Wir befinden uns in dem Schritt, in dem wir unser pelletiertes Pankreas-Digest vorliegen haben.

Wir resuspendieren das Gewebe, sodass es locker auf den Pellets liegt. Wir geben den ersten Dichtegradienten, also 1 1 0 8, hinzu. Wir fügen fünf Mille zu jedem Röhrchen hinzu.

Das Pellet wird dann gründlich in jedem der Gradienten vermischt. Es ist wichtig, dass Sie eine gute Gewebeverteilung in Ihrem schwersten Gradienten erzielen. Nun werden wir zwei Milliliter Dichte 1 0 9 6 aufschichten.

Danach geben wir zwei Mils einer Dichte von 1 0 6 9 darauf, und darauf dann eine Dichte von 1 0 3 7. Es ist wichtig, dass Sie beim Schichten der Dichten keine Vermischung verursachen. Anschließend wurden alle Schichten dem Röhrchen hinzugefügt.

Und Sie können sehen, dass dies die Oberseite von 1 1 0 8, die Oberseite von 9 1 0 9 6, die Oberseite von 1 0 6 9 und die Oberseite von 1 0 3 7 ist. Zudem erkennen Sie, dass sich das Gewebe bereits in Richtung seiner korrekten Dichte bewegt, selbst ohne Zentrifugation. Die Gradienten werden 15 Minuten lang mit 1800 U/min aufgefahren, und denken Sie daran, die Bremse ausgeschaltet zu lassen, nachdem die Röhrchen aus der Zentrifuge entnommen wurden.

Zwischen der 0 0 9 6- und der 0 0 7-Schicht ist ein deutlicher Band von Augs-Gewebe von Pablo sichtbar. Nun wird die 0 3 7-Schicht entfernt, um Gewebetrümmer und DNA zu beseitigen, die während der Verarbeitung freigesetzt worden sein könnten. Mithilfe einer sterilen Kunststoff-Pasteurpipette entfernt er nun die Inselzell-Schicht und überträgt sie in einen 50-ml-Kegelbehälter, der 25 ml Waschpuffer enthält.

Sie sollten diesen Schritt schnell durchführen, da Fol für die Augen giftig ist. Tatsächlich haben wir die gesamte 0 6 9- und 0 9 6-Schicht entfernt. Pavo schneidet die Spitze der Plastik-Pasteurpipette ab und spült sie mit Waschpuffer aus.

Die Augenlöcher werden anschließend zentrifugiert, wie zuvor bereits beschrieben. Die Zentrifuge wird auf tausend U/min hochgefahren, dann gestoppt, und wir aspirieren die Flüssigkeit ab. Die überstehenden Augenlöcher werden dreimal mit Waschmedium gewaschen.

Wir haben soeben den Augenlid-Isolationsprozess abgeschlossen, bei dem wir vom Verdau über den Folgradienten bis hin zu den gereinigten Augenlidchen nach der dritten Wäsche mit Waschpuffer die Augenlidchen in unserem RPMI-Medium resuspendiert und in eine Zellkulturschale überführt haben. Diese Augenlidchen sind nun bereit für In-vitro-Assays oder In-vivo-Präparationen wie die Augenlidchen-Transplantation.