Fokussierten Ionenstrahl-Fräs-und Rasterelektronenmikroskopie des Hirngewebes

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, serielle Bilder durch einen bestimmten Bereich von Gehirngewebe mithilfe der fokussierten Ionenstrahl- und Rasterelektronenmikroskopie aufzunehmen. Dies wird erreicht, indem das Gehirn zunächst in Schnitte geteilt wird, die gefärbt und anschließend in Harz eingebettet werden. Der zweite Schritt besteht darin, den Bereich von Interesse aus dem eingebetteten Gehirnschnitt herauszuschneiden und auf einen leeren Harzblock aufzubringen.

Der dritte Schritt besteht darin, den Harzblock mit einem Ultramikrotom zu trimmen und den Ionenstrahl des Mikroskops zu verwenden, um ausschließlich den zu bildgebenden Bereich zu isolieren. Der letzte Schritt ist, eine Fläche des Harzblocks seriell abzubilden, wobei vor jeder Aufnahme dünne Schichten mithilfe des Ionenstrahls wiederholt entfernt werden. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Serienaufnahmen durch einen Bereich von Interesse zeigen.

Die Bildserie wird automatisch aufgenommen und der Datensatz weist typischerweise isotrope Voxel auf, sodass die Bildstrukturen aus jedem Winkel in der Stapelansicht betrachtet werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der seriellen Schnitt-Transmissionselektronenmikroskopie liegt darin, dass eine wesentlich höhere Z-Auflösung erreicht werden kann. Im Vergleich zur Elektronentomographie ermöglicht sie die Abbildung deutlich größerer Volumina bei einer optimalen Auflösung für in Harz eingebettete Proben.

Das Verfahren beginnt mit der Dissektion des fixierten Gehirns aus einer anästhesierten, perfundierten Ratte. Das Gehirn in warmem 5 % Aeros in einer Kunststoffform einbetten, das Gehirn in den korrekten Winkel ausrichten, bevor das Aeros erstarrt, und den Aeros-Block mit dem eingeschlossenen Gehirn mithilfe eines Vibratomschneiders auf einem Probenträger befestigen. 80 µm dicke koronare Schnitte anfertigen, wobei so viele Schnitte angelegt werden, wie erforderlich sind, um den interessierenden Bereich einzuschließen.

Als Nächstes die Proben in 20-Milliliter-Glasisolierfläschchen geben. Bis zu 10 Schnitte pro Fläschchen platzieren. Die Proben dreimal für jeweils fünf Minuten in 0,1-molarer K-Coate-Pufferlösung spülen.

Färben Sie die Proben anschließend mit 1,5 % Kaliumcyanid und 1 % Osmiumtetroxid in 0,1-molarer K-Coat-Pufferlösung für 30 Minuten. Fahren Sie mit der Färbung der Proben mit 1 % Osmiumtetroxid in 0,1-molarer K-Coat-Pufferlösung für 30 Minuten fort. Danach spülen Sie einmal mit zweifach destilliertem Wasser für drei Minuten und färben anschließend mit 1 % Uracetat in zweifach destilliertem Wasser für 30 Minuten.

Anschließend spülen Sie die Schnitte fünf Minuten lang mit doppelt destilliertem Wasser ab und dehydrieren Sie sie anschließend in einer aufsteigenden Alkoholreihe, wobei Sie für jeden Wechsel zwei Minuten einplanen. Der nächste Schritt besteht darin, die Schnitte in zunehmenden Konzentrationen von Duran-Harz, das mit Alkohol gemischt wurde, einzubetten, wobei zwischen den Wechseln jeweils 30 Minuten eingeplant werden. Beginnen Sie mit einem Verhältnis von 50 zu 50 (Ethanol zu Harz), dann 30 zu 70, dann 10 zu 90 und schließlich setzen Sie die Schnitte 30 Minuten lang 100 % Harz aus.

Ersetzen Sie dann das Medium durch 100 % frisches Duran-Harz. Schütteln Sie langsam eine Stunde lang im Rollenmischer. Nach der Einbettung bringen Sie die Schnitte mit einem Holzspatel auf Glasobjektträgern auf, die zuvor mit Trennmitteln für Formen beschichtet wurden.

Bringen Sie so viele Schnitte wie möglich auf den Objektträgern unter, vermeiden Sie jedoch eine Überfüllung der Objektträger. Stellen Sie sicher, dass auch ein Identifikationsetikett zwischen den Objektträgern angebracht wird. Legen Sie die Objektträger 24 Stunden lang in einen 65 °C heißen Ofen.

Am nächsten Tag die Proben aus dem Ofen nehmen. Vorsichtig eine Rasierklinge zwischen die Glasobjektträger schieben und die Harzschicht mit den Proben herausnehmen, wobei die Harzschicht mit den Fingern festgehalten wird. Die Probe vorsichtig unter fließendem Wasser abwaschen.

Um eventuelle Formtrennmittel zu entfernen, platzieren Sie die Probe unter einem Stereomikroskop mit Durchlichtbeleuchtung und verwenden Sie ein Objektiv mit niedriger Vergrößerung. Markieren Sie den Bereich von Interesse mit einer feinen Nadel. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um ein kleines, drei Millimeter mal drei Millimeter großes Quadrat um den Bereich von Interesse herum auszuschneiden.

Verwenden Sie Acrylkleber, um den kleinen Harzblock an der Oberseite eines unbeschrifteten Harzblocks zu befestigen. Danach klemmen Sie den Block in den Halter des Ultramikrotoms ein. Blicken Sie durch das angebrachte Stereomikroskop und verwenden Sie eine Rasierklinge, um den Bereich von Interesse so einzuschneiden, bis nur noch eine kleine Pyramide aus Material übrig bleibt.

Schneiden Sie die Kante des Blocks nahe der Region von Interesse mit einem am Ultramikrotom befestigten Glas-Messer in einem Winkel zur oberen Blockoberfläche ab. Beschneiden Sie den Block weiter, sodass die Region von Interesse genau in Bezug auf die Abmessungen der Blockoberfläche lokalisiert werden kann. Entfernen Sie den Block vom Ultramikrotom und platzieren Sie ihn unter einem Durchlichtmikroskop.

Fotografieren Sie den interessierenden Bereich. Verwenden Sie eine Juweliersäge, um den zugeschnittenen Block mit Kohlepaste vom restlichen Harzansatz abzutrennen. Befestigen Sie den SA-Block auf einem REM-Probenhalter und richten Sie ihn so aus, dass die zu bildgebende Seite zur äußersten Kante zeigt.

Nachdem der Kleber getrocknet ist, überführen Sie die Präparation in ein Halbmondsystem und ein Vakuumverdampfungssystem, und beschichten Sie den Block mit einer dünnen Goldschicht von mehr als 20 Nanometern. Der in Harz eingebettete Gewebeprobeblock ist nun bereit, im fokussierten Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskop abgebildet zu werden. Führen Sie die Probe in ihrem Halter bei niedriger Vergrößerung in das Mikroskop ein und richten Sie unter Verwendung der Sekundärelektronenabbildung den Block so aus, dass der interessierende Bereich und die zu bildgebende Seite des Blocks nach vorne zeigen.

Der Bediener richtet den Block so aus, dass die zu bildgebende Fläche parallel zum Frässtrahl liegt. Dadurch wird der Elektronenstrahl unter einem Winkel von 54 Grad zu dieser Fläche ausgerichtet, wobei ein Ionenstrahlstrom von 13 bis 27 Nanoampere bei 30 Kilovolt verwendet wird.

Entfernen Sie ein schmales Harzband von der Vorderseite des zu bildgebenden Bereichs. Wechseln Sie anschließend in den Rückstreumodul, um die präparierte Fläche zu betrachten, die über dem interessierenden Bereich liegt. Mithilfe des zuvor aufgenommenen Referenzbildes der Lichtmikroskopie und des Bildes der präparierten Fläche lokalisieren Sie den genauen Bereich am Block, der unter Verwendung des Gasinjektionssystems des Mikroskops präpariert und abgebildet werden soll.

Tragen Sie mithilfe eines Stroms von 700 Pikoampere eine schützende Schicht aus Kohlenstoff oder Metall mit einer Dicke von etwa einem Mikrometer auf die Oberfläche des Blocks über dem interessierenden Bereich auf. Schließlich bearbeiten Sie den Bereich des Blocks, innerhalb dessen die endgültigen Bilder aufgenommen werden. Lassen Sie den Bearbeitungsstrahl diese Bildoberfläche vollständig bearbeiten, bis keine Bearbeitungsartefakte mehr auf der Oberfläche sichtbar sind.

Wählen Sie die Mikroskop-Parameter für die serielle Abbildung der Fläche aus. Typische Parameter sind Spannungen zwischen 1,2 und zwei Kilovolt mit Pixelgrößen zwischen vier und 20 Nanometern. Die Pixel-Belichtungszeit sollte etwa 10 Mikrosekunden betragen, sodass die Gesamtzeit zum Fräsen der Fläche und zur Aufnahme eines Bildes unter zwei Minuten liegt.

Lassen Sie das Mikroskop mindestens zwei Stunden ruhen, um thermische Veränderungen auszugleichen. Starten Sie danach den Mahl- und Abbildungsprozess, um Serienaufnahmen durch den Bereich von Interesse zu gewinnen. Diese Abbildung zeigt das invertierte Kontrast-Bild der rückgestreuten Elektronen der Blockoberfläche, das die Ultrastruktur innerhalb eines Bereichs des umhüllten Gehirns darstellt.

Alle Membranen sowie große makromolekulare Strukturen sind sichtbar. Diese Abbildung setzt sich aus insgesamt 1.600 Bildern zusammen, die im Abstand von fünf Nanometern aufgenommen wurden und einen Bildstapel mit isotropen Voxel ergeben. Dieser Stapel kann in jeder Ebene mit derselben Auflösung dargestellt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Gehirngewebe für die serielle Bildgebung mit dem fokussierten Ionenstrahl-Scanning-Elektronenmikroskop vorbereitet.