Imaging C. elegans Embryos mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop und Open Source Software

Dieses Protokoll zeigt, wie dynamische Vorgänge in frühen C. elegans-Embryonen mit DIC-Optik von Norky oder Fluoreszenz unter Verwendung weit verbreiteter Mikroskope und Open-Source-Software abgebildet werden können. Zunächst wird beschrieben, wie C. elegans-Embryonen präpariert und zur Bildaufnahme montiert werden. Anschließend wird die korrekte Einstellung der DIC-Norky-Optik erläutert, um optimale Bilder mit höchster Detailgenauigkeit zu erzielen.

Die Kalibrierung der Weitfeld-Epi-Fluoreszenz und Beleuchtung wird ebenfalls im Hinblick auf die Erfassung qualitativ hochwertiger fluoreszenter Bilddaten in Kombination mit Open-Source-Software behandelt. Eine gute Mikroskopie kann zelluläre Dynamiken in einem sich entwickelnden Embryo sichtbar machen. Visuelle Darstellungen dieser Methode sind entscheidend, da die korrekte Einrichtung der D iic-Optik schwierig ist, da die Terminologie verwirrend sein kann und die richtige Technik schriftlich schwer zu beschreiben ist.

Des Weiteren sollten Forscher darauf achten, die Lichtexposition bei der Durchführung fluoreszenter Bildgebung möglichst gering zu halten. Um die Phototoxizität und Photobleiche zu begrenzen, bereiten Sie zunächst zwei Montierungslösungen vor. Eine besteht aus geschmolzenem Vaseline und die andere aus zwei bis 3 % Aros im Puffer.

Dichtere Agarosen können hergestellt werden, wenn die abzubildenden Strukturen sehr empfindlich sind, wobei darauf geachtet werden muss, ein Sieden zu vermeiden. Beide Stammlösungen werden in der Mikrowelle geschmolzen und anschließend als vier bis fünf Milliliter-Aliquote aufbewahrt. Am Tag der Bildgebung wird ein Aliquot der Vaseline-Lösung in einem Wärmeblock bei 65 bis 70 Grad Celsius und ein Aliquot der Agarose-Lösung in der Mikrowelle geschmolzen.

Auch hier erneut das Kochen vermeiden. Bewahren Sie diese Lösungen anschließend zur Aufrechterhaltung des flüssigen Zustands in einem Wärmeblock auf. Als Nächstes bedecken Sie die Ober- und Unterseite von zwei Objektträgern mit einem Streifen Laborband und platzieren einen sauberen Objektträger zwischen den beiden verklebten Objektträgern.

Geben Sie nun einige Tropfen der geschmolzenen Aros auf einen sauberen Objektträger und bedecken Sie sie mit einem weiteren sauberen Objektträger. Die Aros verteilen sich zu einem dünnen, quadratischen Polster, wobei das Wurmpolster vorbereitet ist. Verwenden Sie ein Stereomikroskop und einen Platindraht, um zwei adulte Würmer in einen Tropfen Puffer von neun bis zwölf Mikroliter auf einem 18 mal 18 Millimeter großen Deckglas zu überführen.

Dann schneiden. Öffnen Sie die Würmer mit einer Nadel oder einem Skalpell, um die Embryonen freizusetzen, wobei die Agarose-Seite nach unten zeigt. Platzieren Sie das Wurmkissen auf dem 18 mal 18 Millimeter großen Deckglas und schaben Sie überschüssiges Agar ab.

Um den Deckelrand schließlich abzudichten, trägt man mit einem Pinsel oder Zahnstocher die geschmolzene Vaseline-Lösung entlang des Randes auf. Die Zellen sind nun bereit zur Bildgebung. Wenn man das Objektträger auf dem Mikroskop platziert, muss sichergestellt werden, dass die beiden Polarisatoren senkrecht zueinander ausgerichtet sind.

Stellen Sie sicher, dass sowohl der Waller als auch die Prismen außerhalb des Lichtwegs sind. Falls das Feld nicht dunkel ist, drehen Sie den Polarisator unterhalb des Kondensors, bis dies der Fall ist. Suchen Sie die Embryonen mit dem 10-fachen Objektiv.

Suchen Sie in der Nähe der Wurmkörper nach Gruppen junger Embryonen, um mehrere Embryonen im Bildfeld zu erhalten. Vermeiden Sie Embryonen innerhalb des Wurms, um die besten Bilder zu erzielen. Sobald die besten Embryonen lokalisiert sind, wechseln Sie zu einem Objektiv mit höherer Vergrößerung.

Wechseln Sie nun den Filtercubus zu DIC. Fügen Sie als Nächstes das obere Objektiv-Walston-Prisma in den Lichtweg ein und drehen Sie am Drehteller am Kondensor, um das untere Walston-Prisma auszuwählen, das zum Objektiv passt. Mit eingesetzten Prismen stellen Sie den Schieberegler unterhalb dieses Drehtellers so ein, dass er zur numerischen Apertur der Linse passt.

Um die optimale Köhler-Beleuchtung zu erreichen, justieren Sie den Kondensor, bis die Kante der Kondensorblende am schärfsten erscheint. Am schärfsten ist dann der Fall, wenn die Grenze zwischen hell und dunkel am klarsten oder fokussiertesten ist. Um den optimalen Kontrast zu erzielen, stellen Sie die Apfelwand und das Prisma ein, indem Sie den Knopf am Schieberegler drehen.

Nun ist das Mikroskop nahezu betriebsbereit. Es ist an der Zeit, zusätzliche Bildgebungsparameter am Computer mit der Open-Source-Software Micromanager zu steuern. Beginnen Sie damit, die Kameraverstärkung auf null einzustellen.

Danach auf das Speichern von Dateien als 8-Bit- statt als 16-Bit-TIFF umstellen. TIFF-Dateien können anschließend mit Open-Source-Software wie ImageJ analysiert werden. Als Nächstes justieren Sie die Lichtintensität so, dass die hellsten Pixel knapp unterhalb der Sättigungsgrenze liegen. Wenn alles korrekt durchgeführt wurde, wirkt das Bild dreidimensional, als ob das Licht schräg einfällt.

Nun, da das Bild hervorragend aussieht, wählen Sie die Embryonen aus, die Sie abbilden möchten, und zeichnen Sie einen interessierenden Bereich. Falls das Mikroskop über einen Fokusmotor verfügt, nutzen Sie diesen, um zu jedem Zeitpunkt mehrere Fokusebenen aufzunehmen. Öffnen Sie das Fenster für die mehrdimensionale Aufnahme und legen Sie die obere und untere Ebene des Z-Stapels fest, indem Sie den Fokusknopf justieren, um die erste und letzte Fokusebene zu finden, in der noch einige Yolk-Granula scharf sind.

Stellen Sie die Schrittweite ein. Dies legt die Anzahl der aufgenommenen Fokusebenen fest. Legen Sie nun ein Zeitintervall fest, das lang genug ist, um alle Fokusebenen zu erfassen.

Die maximale Anzahl von Zeitpunkten kann sehr hoch eingestellt werden, sodass die Software Bilder aufnimmt, bis sie manuell gestoppt wird. Stellen Sie die Software so ein, dass nur das zuletzt aufgenommene Bild angezeigt wird, um den Prozess überwachen zu können. Geben Sie den Bildern nun einen Dateinamen und beginnen Sie mit der Bildaufnahme.

Die Bildanalyse wird am Ende des nächsten Abschnitts kurz erläutert. Die Erstellung eines GFP-Videos ähnelt stark der Aufnahme von vier D nor Musky DIC, jedoch wird eine Konfigurationsdatei verwendet, die die Softwaresteuerung des fluoreszierenden Shatters beinhaltet. Sobald die Embryonen positioniert sind, stellen Sie sicher, dass das obere Walstone-Prisma nicht im Lichtweg befindet, und schalten Sie den Filterwürfel auf F-I-T-C-G-F-P um.

Falls dies beim Starten der Software nicht automatisch aktiviert wurde, stellen Sie sicher, dass die Kameraverstärkung auf 255 eingestellt ist. Eine Bilddatei wird im 16-Bit-TIFF-Format festgelegt. Schalten Sie nun die durchgehende Lichtquelle aus und klicken Sie auf Live-Bildaufnahme.

Passen Sie die Intensität der UV-Lichtquelle und die Belichtungszeit an, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis für das Fluoreszenzsignal zu erzielen; halten Sie jedoch die Lichtbelichtung so gering wie möglich, um die Zellen zu schonen. Stellen Sie anschließend das Zeitintervall ein. Die Anzahl der Zeitpunkte und die Anzahl der Fokusebenen festlegen und dann mit der Bildaufnahme wie zuvor beschrieben fortfahren.

Zur Analyse der Filme verwenden Sie Open-Source-Software. ImageJ mit installiertem Micromanager-Plugin. Sehr große Filme können auch mithilfe des LOCI-Plugins in ImageJ importiert werden. Dies ist ein Wildtyp-Embryo, aufgenommen mit Nomarski, DIC-Optik.

Posterior liegt rechts unten und ventral links unten. Der Film zeigt eine Abfolge von Einzelbildern aus einer Fokusebene, die alle 15 Sekunden aufgenommen wurden. Die Wiedergabe erfolgt mit 14 Bildern pro Sekunde.

Dieses Embryo zeigt Fluoreszenz während der ersten embryonalen Teilung, wobei hier posterior oben rechts liegt. Dieser Film zeigt die Veränderungen in einer einzelnen Fokusebene alle 10 Sekunden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie lebende Embryonen mithilfe sowohl DIC-Nomarski-Optik als auch Epi-Fluoreszenz abgebildet werden können, um dynamische Vorgänge zu untersuchen.

Wir hoffen, dass Sie nun ein besseres Verständnis dafür haben, wie man DIC-Nomarsysteme einrichtet, um optimale Bilder zu erhalten, und erkennen, dass hochwertige fluoreszierende Daten auch mithilfe der Epi-Fluoreszenz-Beleuchtung gewonnen werden können, ohne immer auf fortschrittlichere Mikroskope angewiesen zu sein. Sie können diese Bildgebungsverfahren auch anwenden, um Embryonen zu untersuchen, denen eine bestimmte Genfunktion fehlt, um die genetischen Voraussetzungen für Ihre bevorzugten Vorgänge während der Zellteilung oder Entwicklung weiter zu erforschen.