Bimolekularen Fluoreszenz Komplementation

Dieses Experiment zielt darauf ab, festzustellen, ob zwei Proteine in Zellen miteinander interagieren, und Aspekte der Bindungsstellen dieser Interaktion zu charakterisieren. Zunächst werden Zellen mit Expressionskonstrukten transfiziert, die die beiden Proteine der Untersuchung codieren, wobei eines an das endständige Fragment eines aufgeteilten fluoreszierenden Proteins fusioniert ist und das andere an das komplementäre C-terminale Fragment desselben aufgeteilten fluoreszierenden Proteins. Nachdem den transfizierten Zellen Zeit gegeben wurde, in der Kultur ein fluoreszierendes Signal zu entwickeln, werden die Protein-Komplexe durch Bildgebung und Immunsouthern (Immuno Blotting) sichtbar gemacht.

Anschließend werden die gesammelten Bilder in Bildgebungssoftware wie Image J exportiert, um die durchschnittliche Fluoreszenzintensität pro Zelle zu quantifizieren. In einem kontrollierten Experiment können BIFC-Ergebnisse Protein-Protein-Interaktionen sowie die Lokalisation dieser Komplexe aufzeigen, wie beispielsweise die SH3-Domänen des Gerüstproteins Intersectin und die prolinreiche Domäne von PI3KC2β. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie Kolokalisation, Immunpräzipitation und FRET besteht darin, dass BFC die räumliche Lokalisation schwächerer, vorübergehender Interaktionen in der Zelle ermöglicht. Außerdem erfordert diese Methode keine umfangreiche Nachbearbeitung der Bilder, wie sie bei FRET beobachtet wird.

Diese Methode kann wichtige Fragen im Bereich der Signaltransduktion beantworten, beispielsweise, ob die Proteine X und Y miteinander interagieren, und wenn ja, in welchen spezifischen Kompartimenten diese Komplexe in der Zelle lokalisiert sind. In der Regel haben Neulinge bei dieser Methode Schwierigkeiten, da sie nicht die geeignete Konfiguration für die Expression ihrer Biopsie gewählt haben. Beginnen Sie mit der Auswahl eines der mehreren Fluorophore für die BIFC-Fusionsproteine, um die markierten Proteine von Interesse zu exprimieren.

Beachten Sie, dass die Amino- und Carboxytermini von Venus bei 37 Grad Celsius in der Lage sind, einen Komplex zu bilden, während die Y-F-P-B-I-F-C-Fragmente eine Vorinkubation bei 30 Grad Celsius erfordern. Entwerfen Sie Expressionsvektoren zur Anbringung von Tags an die Proteine von Interesse, indem Sie berücksichtigen, wie die Anheftung der BIFC-Fragmente die Funktion der Proteine von Interesse beeinflussen könnte. Beispielsweise sind Proteine der RAs-Familie, GTPasen, am Carboxytermin durch Lipidmodifikation markiert und können an diesem Ende nicht markiert werden, ohne diese Modifikation zu stören.

Führen Sie stets Vorversuche durch, um die Transfektionsbedingungen zu bestimmen. Überwachen Sie die Zellen außerdem mittels Fluoreszenzmikroskopie, um einen optimalen Zeitpunkt für die Signalentwicklung zu identifizieren. Führen Sie anschließend eine Western-Blossom-Analyse durch, um eine gleichmäßige Expression der Konstrukte zu bestätigen.

Wichtig ist, eine Immunfärbung für das HA- oder Flag-Tag durchzuführen, um zu überprüfen, ob die Hinzufügung der BIFC-Fragmente die zelluläre Lokalisation der Proteine von Interesse für jede Probenplatte verändert. 1,3 × 10⁵ Zellen jeder Art je auf eine Glasboden-Multiwellplatte und zwei Vertiefungen einer 6-Well-Platte geben und die Zellen über Nacht in einem 37 °C warmen Inkubator anschließen lassen. Am nächsten Tag DNA für die Transfektion mittels Lipofektion oder einer anderen bevorzugten Methode vorbereiten.

Zunächst verdünnen Sie die DNA in 250 Mikrolitern serumfreiem DMEM als Transfektionskontrolle. Geben Sie CFP im Verhältnis 1:50 hinzu, entsprechend der Menge Ihrer gesamten BIFC-DNAs. Verdünnen Sie nun das Lipid in 250 Mikrolitern serumfreiem DMEM, wobei Sie 10 Mikroliter Lipid pro Mikrogramm DNA verwenden.

Vermischen Sie die DNA- und Lip-Dilutionen und inkubieren Sie 20 Minuten bei Raumtemperatur. Spülen Sie die Zellen zweimal mit warmem, serumfreiem DMEM aus. Geben Sie zwei Milliliter serumfreies DMEM in jede Glasbodenplatte oder jedes Loch einer sechswelligen Platte.

Teilen Sie dann jede Transfektionsmischung gleichmäßig auf eine Glasboden-Schale und zwei Vertiefungen einer sechs-Loch-Platte auf und inkubieren Sie die Zellen 5 Stunden bei 37 Grad Celsius. Entfernen Sie abschließend das Transfektionsmedium und ersetzen Sie es durch komplettes DMEM ergänzt mit 10 % FBS.

Die Zellen für die in Vorversuchen bestimmte Zeit inkubieren, um die erforderlichen Expressionslevel der Proteine von Interesse zu erreichen. Die transfizierten Zellen unter einem epifluoreszierenden Mikroskop untersuchen, um sicherzustellen, dass die positive Kontrolle fluoresziert. Die Zellen dreimal mit PBS spülen, um lebende Zellen abzubilden.

Bringen Sie die Zellen in Medium ohne Indikatorfarbstoffe. Zum Abbilden fixierter Zellen. Geben Sie 2 % Parafomaldehyd hinzu und stellen Sie 10 Minuten auf Eis.

Anschließend die Zellen dreimal mit PBS spülen, jetzt mit einem Milliliter PBS bedecken und im Dunkeln bei vier Grad Celsius lagern, die Zellen in der 6-Loch-Platte sofort lysieren. Für Western-Blot-Analysen ist es wichtig, dass alle Zellen gleichzeitig vorbereitet werden, damit die lysierten Zellen repräsentativ für die Bildzellen sind. Führen Sie einen Western Blot durch, um sicherzustellen, dass die Tag-Proteine in äquivalenten Mengen exprimiert werden.

Bei der Bildgebung von Zellen mit einem konfokalen Mikroskop ist es wichtig, die Einstellungen während des gesamten Experiments konstant zu halten, damit die Fluoreszenz zwischen den Proben vergleichbar ist. Stellen Sie sicher, dass einzelne Zellen abgebildet werden, bei denen die Pixel nicht gesättigt sind. Da CFP als Transfektionskontrolle verwendet wurde, wählen Sie nur CFP-positive Zellen zur Analyse der BIFC-Signale aus.

Quantifizieren Sie die Fluoreszenz mithilfe einer Bildanalyse-Software wie ImageJ. Öffnen Sie die Bilddateien in ImageJ. Gehen Sie zu „Analysieren“ und wählen Sie „Messungen einstellen“. Aktivieren Sie die Felder für Fläche und mittleren Grauwert in der Messbox. Beachten Sie, dass in diesem Beispiel venöse Bilder künstlich grün und CFP-Bilder künstlich rot eingefärbt wurden.

Verwenden Sie das Freihand-Auswahlwerkzeug, um eine Umrisslinie entlang der Kante der gesamten Zelle im CFP-Kanal zu zeichnen, und belassen Sie diesen Umriss an Ort und Stelle. Wechseln Sie zum YFP-Kanal. Gehen Sie zu Analysieren und messen Sie den mittleren Grauwert, der die durchschnittliche Fluoreszenzintensität pro Zelle für jedes Bild widerspiegelt.

Zeichnen Sie einen Kreis im YFP-Kanal in einem Bereich, der keine Zelle enthält. Nehmen Sie eine Messung für diesen Bereich als Hintergrund vor. Subtrahieren Sie den Hintergrund von jedem Bild.

Schließlich, um die durchschnittliche Fluoreszenzintensität für eine Zellpopulation zu berechnen, mitteln Sie den mittleren Grauwert abzüglich des Hintergrunds für alle in einer Probe abgebildeten Zellen. Idealweise quantifizieren Sie 60 Zellen über drei Experimente hinweg. Das mehrdomänige Gerüstprotein Intersectin reguliert das neuronale Überleben durch die Regulation einer neuartigen Klasse-II-PI-3-Kinase, PI3KC2β. Intersectin SH3-Domänen interagieren mit der aminoterminalen prolinreichen Region von PI3KC2β. Die Transfektion von mit VN markiertem Intersectin mit mit VC markiertem PI3KC2β führt zu einem fluoreszierenden Signal im YFP-Kanal, das grün pseudofärbt dargestellt wird und die Komplexbildung anzeigt.

CFP, hier fälschlicherweise rot dargestellt, dient als Kontrolle zur Markierung transfizierter Zellen. Mutationen in der prolinreichen Domäne von PI-3-Kinase C2β, die die Co-Präzipitation von Intersectin und PI-3-Kinase C2β stören, verringern das BIFC-Signal. Dieser Unterschied im BIFC-Signal beruht nicht auf Unterschieden in der Expression der Wildtyp- und der PA-PI-3-K-Proteine. Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von drei Tagen durchgeführt werden. Während der Durchführung dieses Verfahrens müssen Sie darauf achten, die geeigneten Kontrollen durchzuführen und die Proteinexpression zu überprüfen, um sicherzustellen, dass Unterschiede im BIFC-Signal auf Unterschieden in der Komplexbildung und nicht auf Unterschieden in der Expression beruhen.

Andere Techniken wie die Oberflächen-Plasmonenresonanz können durchgeführt werden, um Fragen zu beantworten, beispielsweise welche unterschiedlichen Affinitäten diese Komplexe untereinander aufweisen.