Mapping und Anwendung von Enhancer-trap Flippase Expression in Larven und Erwachsene Drosophila CNS

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die GAL4-Expression durch die Verwendung eines gewebespezifischen Lipases in Kombination mit GAL80-Umwandlungswerkzeugen zu verfeinern. Dies wird erreicht, indem eine Sammlung von Enhancer-Trap-Philippe-transgenen Fliegenlinien erzeugt und das Expressionsmuster der Lipase im zentralen Nervensystem (ZNS) in jeder Linie bestimmt wird. Mithilfe einer GFP-Reporter-Immunchemie und GFP-Berichtssystemen können GL- von neuronaler Expression unterschieden werden, um die GAL4-Expression in den interessierenden ET-flip-Linien bei den Nachkommen der Fliegen, die ein GAL80-Umwandlungswerkzeug enthalten, zu überlappen.

Mithilfe der klonalen Analyse kann die Verfeinerung der GAL4-Expression, beispielsweise im Auge, untersucht werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass Enhancer-Trap-Linien in Kombination mit GAL80-konvertierenden Werkzeugen verwendet werden können, zusammen mit einer umfangreichen Sammlung bereits in der Fliegen-Community verfügbaren GAL4-Linien. Zudem kann dieses Konzept auf andere GAL4/UAS-Modellorganismen wie Zebrafische erweitert werden.

Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen bei der Kartierung neuronaler Schaltkreise, die Verhaltensweisen zugrunde liegen, zu beantworten. Obwohl dieses Protokoll die Verwendung von Flip-Basen in einer Untermenge von Photorezeptorzellen demonstriert, kann die intersectionelle Methode auch zur Analyse anderer Gewebe, einschließlich nicht-neuronaler Gewebe, angewendet werden. Sofern mehr Enhancer-Trap-Lipase-Linien charakterisiert werden.

Gout vier US ist eine wichtige Technik, die weit verbreitet von Fliegenbiologen verwendet wird. Ein Nachteil der meisten GAL-vier-Linien ist, dass sie zu breit exprimiert werden, um mit den Fingermethoden für die Abbildung von Gehirnverhalten eingesetzt zu werden. Es ist nicht möglich, die GAL-vier-Expression in interessierenden T-Shirts feinabzustimmen, bevor man ein ET-Flip-Transgen verwendet, um die Expression von GAL-vier-Expressionslinien teilweise einzuschränken.

Zunächst ist es hilfreich, das Expressionsmuster des ET flip x zwei-Transgens in fortgeschrittenen Entwicklungsstadien der Larven und bei Erwachsenen zu kennen, um die Expression von flip a im ZNS zu visualisieren. Stellen Sie eine Kreuzung zwischen Männchen mit dem ET flip X zwei-Transgen von Interesse und jungfräulichen Weibchen her, die einen GFP-Reporter für die et flip-Expression enthalten. Sammeln Sie wandernde F1-Larven des dritten Instars für die Präparation. Geben Sie sie in eine saubere S-Schild-Dish, entfernen Sie Verunreinigungen mit einem Pinsel und spülen Sie die Schale einmal mit 1× PBS aus.

Füllen Sie die Petrischale nun mit eiskaltem 1× PBS, um die Larven zu betäuben, um Zugang zum ZNS zu erhalten. Halten Sie den Mundhaken einer Larve mit einer Pinzette fest. Greifen Sie das Cuticula in der Nähe der vorderen sphärischen Ausstülpung und ziehen Sie es zurück. Das ZNS bleibt zusammen mit einigen anderen Strukturen am Mundhaken haften.

Entfernen Sie nun mit einer Pinzette alle überschüssigen Strukturen, die das ZNS umgeben, während Sie das ZNS präparieren. Überführen Sie sie einzeln in eine dreigeteilte Pyrex-Schale, gefüllt mit PBS. Sobald alle ZNS präpariert sind, fixieren Sie sie, indem Sie sie vollständig in 200 Mikroliter 4 % PFA auf Eis eintauchen.

Falls ein ZNS schwimmt, wurde es nicht vollständig von dem umgebenden Gewebe befreit. Sollte dies der Fall sein, verwenden Sie eine Pinzette, um das ZNS erneut in das Fixativ einzutauchen, nachdem es 15 Minuten fixiert wurde. Waschen Sie das Gewebe dreimal mit eiskaltem PBS und anschließend noch dreimal mit eiskaltem PBT. Das Gewebe ist nun bereit, entweder abgebildet oder mit Antikörpern markiert zu werden, oder kann bei vier Grad Celsius in PBT für spätere Analysen aufbewahrt werden.

Färbung aus demselben Kreuz, das verwendet wurde, um Larven zu sammeln, um F1-Erwachsene vor der Dissektion zu erhalten. Fünf bis zehn Fliegen untergetaucht und 30 Sekunden lang in 95 % Ethanol gekühlt, um das Wachs auf der Oberfläche der Cuticula zu entfernen. Um das Ethanol zu entfernen, die erwachsenen Fliegen dreimal mit eiskaltem 1× PBS gewaschen und nach dem dritten Waschgang eine davon in eine 35-Millimeter-Silikon-Schutzschale überführt, die mit eiskaltem 1× PBS gefüllt ist, um einen Erwachsenen für die Dissektion vorzubereiten.

Platzieren Sie es mit der Bauchseite nach oben und stechen Sie eine Minion-Nadel in die Mitte des Abdomens. Beginnen Sie die Dissektion, indem Sie mit einer Pinzette die Beine entfernen. Entfernen Sie dann die Kopfkutikula, indem Sie den Kopf an den Vorderbeinen fixieren und gleichzeitig die Kutikula von unterhalb des Auges in Richtung Oberseite des Kopfes ablösen.

Entfernen und verfolgen Sie vorsichtig mit einer geschärften Pinzette das umliegende Gewebe des Gehirns, da dieses Gewebe eine starke Autofluoreszenz aufweist und das Gehirn während der Fixierung zum Schwimmen bringen kann. Das Gehirn ist nur ein Teil des adulten zentralen Nervensystems. Der andere Teil ist die ventrale Nervenkordel oder VNC im Thorax, die ebenfalls disseziert werden muss.

Zuerst wird das thorakale Cuticula entfernt, indem die Fliege am Ansatz des Hinterbeins fixiert und das thorakale Cuticula vorsichtig bis zum Halsansatz abgezogen wird. Danach wird das VNC freigelegt, indem die beiden Hälften des thorakalen Cuticula vorsichtig auseinandergezogen werden. Anschließend wird der Abdomen vom Thorax getrennt, indem am Ansatz des zweiten Beins fixiert und der Abdomen nahe der ersten abdominalen Stirnrippe abgezogen wird.

Viertens reinigen Sie das VNC, indem Sie im humeralen Bereich fixieren und vorsichtig das das VNC umgebende Gewebe abtrennen. Lösen Sie den Ring aus Bindegewebe um die Halsverbindung und entfernen Sie weiterhin überschüssiges Gewebe, während Sie das Gehirn sammeln. Überführen Sie das Gehirn und das VNC dann wie Birnen in eine 9-Loch-Pyrex-Schale, die mit gekühlter 1×-PBS gefüllt ist und auf Eis steht.

Um die erwachsenen Gewebe zu fixieren, tauchen Sie diese für 15 Minuten in 4 % PFA auf Eis ein. Anschließend führen Sie drei Waschungen mit eiskaltem PBS und drei Waschungen mit PBT durch. Das Gewebe ist nun bereit, entweder direkt bildgebend untersucht oder mit Antikörpern markiert zu werden, um die Transgenexpression genau analysieren zu können.

Es ist sinnvoll, das zentrale Nervensystem mit neuronalen oder glialen Markern zu markieren, um eine Referenzgrundlage zu schaffen. Beginnen Sie damit, das Gewebe am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius mit Antikörpern gegen Neuronen oder Gliazellen zu inkubieren. Spülen Sie die Probe danach fünfmal mit PBT und inkubieren Sie sie zwei Stunden bei Raumtemperatur mit dem fluoreszierenden Sekundärantikörper. Wickeln Sie die Platte in Folie, um eine Photobleiche des Antikörpers zu verhindern, sobald die Inkubation abgeschlossen ist.

Spülen Sie die Präparation mit PBS und montieren Sie sie ganz auf einen Objektträger. Verwenden Sie einen OSHA-Kunststoffring, um zu verhindern, dass das Gewebe durch die Deckglasplatte zerdrückt wird. Das Nervensystem ist nun bereit, unter einem Fluoreszenzmikroskop auf GFP- und LL-Expressionsmuster untersucht zu werden.

Üblicherweise werden drei bis fünf Wiederholungen untersucht, um die Reproduzierbarkeit des Flip-Expressionsmusters zu bestimmen. Das Expressionsmuster von flip in der flip-Linie kann zusammen mit anderen Transgenen verwendet werden, um die Expression des GAL4-Repressors GAL80 zu verändern. Die Modulation der GAL80-Repressor-Expression ist eine wirksame Methode, um Veränderungen vorzunehmen.

Bei der GAL4-Expression besteht eine Methode darin, die GAL80-Expression durch eine Transgen-vermittelte GAL80-Expression auszuschalten, wodurch GAL4 inaktiviert wird, welches andernfalls eine Degeneration des Auges im gesamten Auge verursacht. Die ET-Flip-Linie mit der Kennung 688A wird hier verwendet, um die Effektivität des GAL80-Umschaltwerkzeugs in einer Teilmenge der Photorezeptoren in der F1-Nachkommenschaft zu bewerten und den Augenphänotyp mit dem der Elternstämme zu vergleichen. Jede sichtbare Augenverformung oder Entfärbung bestätigt, dass das Umschaltmuster in den Photorezeptoren vorliegt und der GAL80-Flipout erfolgreich war.

Eine komplementäre, nicht redundante Strategie besteht darin, die Expression von GAL80 mithilfe derselben interessierenden Flip-Linie einzuschalten. Diese Strategie ähnelt stark der anderen, jedoch wird nun die Pigmentierung und Degeneration in der F1-Nachkommenschaft unterdrückt. In Flip X zwei.

Expression von Photorezeptoren: Sobald die Präparation des ZNS beherrscht ist, kann sie bei Erwachsenen in etwa fünf Minuten und bei Larven in einer Minute durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, scharfe Pinzetten zu verwenden, um die Tracheen und das umgebende Gewebe sowohl von erwachsenen als auch von larvalen C- und Ss-Zellen zu entfernen. Für die Präparation sollte eine fixativfreie Schale verwendet werden. Der Hitzeschock-Flip wird derzeit zur Erzeugung zufälliger Klone eingesetzt.

Im Gegensatz dazu ermöglicht der Enhancer-Trap-Flop die Erzeugung reproduzierbarer Klone, wodurch die morphologische und verhaltensbezogene Analyse erleichtert wird. Eine weitere Stärke der Finger-Methode besteht darin, dass man die GAL4-Expressionsmuster durch den Einsatz zusätzlicher Enhancer-Trap-Flop-Linien und anderer GAL-Linien weiter einschränken kann. Ein Nachteil der Tubulin-Stop-GAL80-Konfiguration ist, dass bestimmte Kombinationen von GAL4 und UAS-Effektoren, wie beispielsweise LAG4 und UAS-KIR, nicht kompatibel sind, da sie die Fliegen töten würden.

Dieses Problem kann leicht durch die Verwendung eines bedingten UAS-Effektors wie UAS Shiri Ts überwunden werden, der es ermöglicht, ein Verhalten bei restriktiven Temperaturen zu untersuchen. Wie erwartet werden nicht alle Enhancer-Trap-Lipase-Linien ausreichend hohe Lipase-Spiegel exprimieren, um nützlich zu sein. Dennoch bietet die hier beschriebene Fingertechnik einen neuen Ansatz für Drosophila-Forscher, die Mosaik-Analyse entweder für Entwicklungsschaltkreise oder für Verhalten zu verfeinern.