Vorgehensweise für Lung Technik

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Lungengewebe in Kultur zu erzeugen, das hinsichtlich Morphologie und Physiologie mit natürlichem Lungengewebe vergleichbar ist. Dies wird erreicht, indem zunächst Herz und Lunge einer erwachsenen Ratte entnommen werden. Im nächsten Schritt werden die Pulmonalarterie und die Trachea kaniert und die kanierten Lungen mit einem Bioreaktor zur Entzellularisierung verbunden.

Nach der Entzellularisierung und dem Spülen wird die Lunge in einen sterilen Kulturbioreaktor überführt und für die Zellbesiedlung vorbereitet. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die gewünschte Lungenkompartiment mit einer vorbereiteten Zellpopulation zu besiedeln. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die mittels Immunfluoreszenzmikroskopie zeigen, dass die entzellularisierte extrazelluläre Matrix effizient mit Zellen besiedelt wurde, die regionalspezifische Lungenmarker exprimieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden zur Kultivierung von Lungenzellen in vitro liegt darin, dass die Zellen differenzierte Phänotypen über einen längeren Zeitraum beibehalten und daher über mehrere Wochen hinweg in einem dreidimensionalen, biologisch abgeleiteten Substrat untersucht werden können. Für die Dekellularisierung werden die Lungen über die vaskuläre Kanüle mit der Bioreaktorkappe verbunden, und die Kappe wird mit der Dekellularisierungsvorrichtung verbunden. Die Glasflasche über den Lungen wird von einem Ringständer und einer befestigten Klammer gehalten.

An diesem Punkt kann das zelluläre Material entfernt werden, um ein Gerüst aus extrazellulärer Matrix herzustellen, das mit zellulärem Material neu besiedelt werden kann. Die Montage des Bioreaktors zur Besiedlung und Kultivierung von konstruiertem Lungengewebe ist in diesem Diagramm dargestellt. Der Luer-Lock-Anschluss der Trachealkanüle verbindet sich mit einer Atemschleife zwischen dem Tracheareservoir und der Hauptkammer.

Die Atemschleife umfasst zwei Einwegventile. Diese sind so positioniert, dass das Medium beim Ein- und Ausströmen aus der Lunge unterschiedliche Wege nimmt. Ein kleines Reservoir wird vorübergehend in die Perfusionsleitung eingebaut, um Endothelzellen einzusemen.

Eine pulsatile arbeitende Pumpe wird verwendet, um Zellen aus dem Reservoir in den vaskulären Kompartiment der Lunge zu befördern. Die vaskuläre Perfusion erfolgt mithilfe einer Rollerpumpe. Das Medium wird über die angeschlossene Kanüle in die Lungenarterie perfundiert, fließt durch das vaskuläre System der Lunge und tritt über die Lungenvene direkt in den Hauptbioreaktor aus, wo es zur erneuten Perfusion angesaugt wird.

Das Lungenepithel wird durch Injektion in die Atemschleife platziert. Die Hauptkammer, die die Lunge und das Tracheareservoir enthält, dient der Langzeitkultur der Lunge. Sobald die Lungen entnommen wurden und die Arterie sowie die Trachea korrekt kaniert sind, sollten die frisch entnommenen Lungen Luft halten, ohne zu lecken.

Dies kann überprüft werden, indem sie unter Flüssigkeit mit Luft aufgeblasen werden. Es sollten keine Blasen auftreten, die auf Luftlecks hindeuten. Um mit dem Protokoll zu beginnen, werden die Lungen mit PBS, der Natriumnitroprussid enthält, aufgeblasen, bis die Lungen voll, aber nicht überdehnt sind; anschließend wird die tracheale Kanüle sofort verschlossen, damit die Lungen aufgeblasen bleiben.

Als Nächstes perfundieren Sie die Lungen mindestens 15 Minuten lang mit PBS und SNP bei 15 Millimeter Quecksilber. Danach entfernen Sie den Stopfen aus der trachealen Kanüle, um den Lungen das Entleeren zu ermöglichen. Setzen Sie die Perfusion bei Bedarf 15 bis 30 Minuten lang mit PBS und SNP fort.

Füllen Sie PBS und SNP erneut auf, um sicherzustellen, dass der Perfusionsdruck bei 10 bis 15 Millimeter Quecksilbersäule gehalten wird. Um mit dem Verfahren für eine lang andauernde Dekellularisierung zu beginnen, wird die Bioreaktorkappe mit der Dekellularisierungsvorrichtung verbunden. Anschließend werden die Lungen mit der Kappe verbunden.

Unter Verwendung der Lock-Verbindungen an der Y-förmigen Kanüle sollte die pulmonale Arterienkanüle mit der Perfusionsleitung verbunden werden, während die tracheale Kanüle frei hängen bleibt. Um eine vollständige Dekellularisierung des Gewebes sicherzustellen, ist es entscheidend, Luft aus dem System fernzuhalten. Die Einwegventile in der arteriellen und trachealen Kanüle helfen, Luftblasen in den Schläuchen zu entfernen, indem sie eine Rückströmung in den Schläuchen ermöglichen.

Daher sollten Luftblasen mit der Spritze entfernt werden; stellen Sie sicher, dass alle Leitungen frei von Luft sind. Beginnen Sie die Perfusion mit der Dekellularisierungslösung. Perfusion mit der Dekellularisierungslösung durchgeführt.

Bis 500 Milliliter Lösung durch die Lungen perfundiert wurden, sollte der optimale Druck unter 15 Millimeter Quecksilber liegen. Dies erfordert typischerweise 2,5 Stunden. Die Flussraten sind anfangs meist sehr gering und steigen in der zweiten Stunde schnell auf etwa ein Milliliter pro Minute oder mehr an.

Während der Perfusion wurde das Dekellularisierungsfluid periodisch aus dem Bioreaktor entnommen, wobei sichergestellt wurde, dass ausreichend Flüssigkeit verblieb, um Lunge und trachealen Kanülen zu stützen. Sobald die Perfusion mit dem Dekellularisierungsfluid abgeschlossen ist, überführen Sie die Lunge und den Bioreaktor in eine Gewebekulturhaube. Um die Organreinigung zu beginnen, entfernen Sie das 500-Milliliter-Gefäß, das das Dekellularisierungsfluid enthält, und ersetzen Sie es durch ein steriles Gefäß mit bis zu einem Liter steriler PBS.

Verwenden Sie Vakuumsaugung oder eine Spritze, um sicherzustellen, dass die Leitungen luftfrei sind, und perfundieren Sie PBS über das Gefäßsystem bei 10 bis 15 Millimeter Quecksilber auf die gleiche Weise. Was die Entzellularisierung betrifft, entfernen Sie unter sterilen Bedingungen regelmäßig abfließendes PBS aus dem Bioreaktor und ersetzen oder füllen Sie das PBS-Gefäß nach. Setzen Sie die Spülung mit frischem, sterilen PBS so lange fort, bis mindestens 2,5 Liter steriles PBS die Lungen durchströmt haben.

Dies dauert in der Regel zwei Tage ab dem Beginn des Entzellularisierungsprozesses, wenn das Spülen abgeschlossen ist. Überführen Sie die Lungen in ein neues steriles Bioreaktorsystem, das frisches PBS plus 10 % FBS plus 10 % Pen/Strep enthält, und stellen Sie sicher, dass sowohl der gesamte Perfusionskreislauf als auch die gesamten Atemwege mit Flüssigkeit gefüllt sind. Ab diesem Zeitpunkt wird eine pulsatile Pumpe verwendet, um die Lungen mit fünf Millimetern pro Minute zu perfundieren.

Sterilisieren Sie das extrazelluläre Matrixgerüst der Lunge durch eine Übernachtsperfusion mit PBS, der 10 % FBS und 10 % Penicillin-Streptomycin enthält. Nach Abschluss dieses Schritts werden die Lungen für eine Stunde oder bis zur Temperaturangleichung in einen 37 °C warmen Inkubator transferiert. Zur Vorbereitung auf die Behandlung mit Ben Nase besteht der nächste Schritt darin, die Lungen mit Ben Nase zu behandeln.

Um restliches DNA für jede Lunge zu entfernen, füllen Sie zunächst eine 10-Milliliter-Spritze ausschließlich mit vorgewärmtem Ben-Nase-Puffer und eine weitere 10-Milliliter-Spritze mit 90 Einheiten pro Milliliter Ben Nase, verdünnt in Ben-Nase-Puffer. Stoppen Sie die Perfusion der Lunge.

Danach die Atemwege mit Ben-Nase-Puffer aufblasen, wobei darauf zu achten ist, keine Luft in den Lungen zu injizieren. Die Lunge eine Minute lang entleeren lassen. Anschließend die Lunge mit der Ben-Nase-Lösung aufblasen.

Auch hier vorsichtig sein, um keine Luft in die Lunge einzubringen, nachdem diese mit Ben Nase aufgepumpt wurde. Die Lungen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius ohne Perfusion oder Ventilation ruhen lassen. Am Ende der einen Stunde die Perfusion mit dem bereits im Bioreaktor befindlichen PBS plus 10 % FBS und 10 % Penicillin-Streptomycin wieder aufnehmen und die Perfusion über Nacht am folgenden Tag fortsetzen.

Nach der Spülung und Sterilisation kann das lange extrazelluläre Matrixgerüst für die zelluläre Rekolonisation vorbereitet werden. Ersetzen Sie die PBS-FBS-Benzol-A-Lösung durch 250 Milliliter Kulturmedium und perfundieren Sie mindestens eine Stunde lang, bevor die Zellen hinzugefügt werden, und wechseln Sie das Medium unmittelbar vor der Zellseeding durch frisches Kulturmedium.

Verschiedene Zellquellen können für die Organrezellulierung verwendet werden. Hier wird die Besiedlung mit einer epithelialen Zellpopulation demonstriert. Bereiten Sie zunächst eine Spritze vor, die 15 Milliliter einer Zellsuspension der gewünschten epithelialen Zellpopulation enthält.

Füllen Sie als Nächstes das Luftwegreservoir mit 80 Milliliter Kulturmedium und stellen Sie sicher, dass alle Belüftungsleitungen frei von Luft sind. Stellen Sie dann den Bioreaktor in einen Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und schließen Sie die Spritzenpumpe für die Belüftung an. Säen Sie die Zellen mittels eines einzigen schnellen Bolus in die Lungen ein, indem Sie die 15-Milliliter-Zellsuspension in die tracheale Kanüle injizieren.

Stellen Sie sicher, dass die Luftfilter am Hauptbioreaktor verschlossen sind. Beginnen Sie dann unverzüglich mit einer einzigen langsamen Entnahme von 60 Millilitern Luft aus dem Hauptbioreaktor mithilfe der Spritzenpumpe bei drei Millilitern pro Minute. Dieser Vorgang dauert etwa 20 Minuten.

Lassen Sie die Lungen danach etwa 18 Stunden lang statisch ruhen. Beginnen Sie die langsame vaskuläre Perfusion mit etwa 0,5 Milliliter pro Minute. Während der Organkultur wird die Perfusion typischerweise mit ein bis drei Milliliter pro Minute durchgeführt.

Bei der Verwendung einer Rollerpumpe in der epithelialen Kultur wird die Belüftung typischerweise kontinuierlich mit einer Frequenz von einem Atemzug pro Minute und einem Schlagvolumen von fünf bis 10 Milliliter bereitgestellt. Mithilfe einer Spritzenpumpe wird Luft zyklisch aus dem Bioreaktor abgezogen und wieder hinein injiziert, um durch Wechsel zwischen Unterdruck und Umgebungsdruck im Hauptkammerinneren eine Atmungsbewegung zu erzeugen. Da während der Belüftung die luftdichte Versiegelung des Bioreaktors gewährleistet sein muss, sollte die Belüftung täglich unterbrochen werden, um die Luft in der Hauptkammer auszutauschen.

Außerdem sollte das Medium etwa alle drei bis vier Tage gewechselt werden. Während der Kultur sollte jedes Mal etwa die Hälfte des Gesamtvolumens ausgetauscht werden, indem das pulmonale Epithel und das vaskuläre Endothel kultiviert werden. In dem im Bioreaktor montierten Scaffold können wir Lungengewebe erzeugen, das für kurze Zeiträume an dem Gasaustausch teilnehmen kann.

Hier ist eine Standard-Hämat-, Ösin- und Eosin-Färbung einer nativen Rattenlunge zur Gegenüberstellung mit einer H-und-E-Färbung einer dezellularisierten Rattenlunge dargestellt. Die finale dezellularisierte extrazelluläre Matrix sollte vollständig frei von zellulärem Material sein und die makroskopischen, mikroskopischen sowie ultrastrukturellen Merkmale der nativen Lunge bewahren. Die H-und-E-Färbung ermöglicht die Sichtbarmachung von eventuell verbliebener DNA, die aufgrund unzureichender Dezellularisierung oder ungenügender Spülung am Gerüst haften bleibt, was die optimalen Bedingungen für die Zellbesiedlung und anschließende Kultur der Lunge beeinträchtigen kann.

Und der Bioreaktor sollte gut verteilte Zellen in allen fünf Lungenlappen liefern und eine Abdeckung von etwa 70 % des extrazellulären Matrixgerüsts gewährleisten. Diese Bilder vergleichen die native Lunge mit der wiederbesiedelten Lunge nach Färbung mittels Immunfluoreszenz. Für wichtige Lungenmarker zeigt die kultivierte Zellpopulation Positivität für das Clara-Zell-sekretorische Protein, das pro-sekretorische Protein C sowie Aquaporin 5.

Die Marker von Interesse sind in allen Darstellungen rot markiert und die mit DAPI gefärbten Zellkerne sind blau. Wenn die Methode einmal beherrscht ist, kann der gesamte Vorgang von der Entzellularisierung bis zur Rezidivierung in vier bis fünf Tagen durchgeführt werden, sofern er ordnungsgemäß durchgeführt wird.