Geändert Maus embryonalen Stammzellen basierte Assay zur Quantifizierung von Kardiogener Induction Efficiency

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die entscheidende zeitliche Regulation zu identifizieren, die für die Differenzierung von Kardiomyozyten in embryonalen Stammzellen der Maus erforderlich ist. Dies wird erreicht, indem zunächst embryonale Körperchen in einer 96-Loch-Rundbodenplatte gebildet werden, um die EB-Bildung zu standardisieren, was als zweiter Schritt dient. Über einen vorbestimmten Zeitraum hinweg werden den EBs Protein- oder chemische Modulatoren hinzugefügt, wodurch eine zeitliche Kontrolle der untersuchten Signalwege ermöglicht wird.

Anschließend werden die schlagenden EBS manuell quantifiziert, um die Induktionseffizienz verschiedener Signalmodulationsschemata zu bestimmen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen die zeitlichen Anforderungen essentieller Signalwege für die Differenzierung zu Kardiomyozyten auf, basierend auf dem Prozentsatz gebildeter schlagender EBS sowie der Bestätigung mittels der Hanging-Drop-Methode. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie den Hanging Drops besteht darin, dass sie ein arbeitsintensives Verfahren standardisiert und vereinfacht und eine direkte quantitativen Auswertung ermöglicht.

Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Stammzellbiologie beantworten, beispielsweise die Identifizierung wesentlicher Signalwege, die die Differenzierung in den gewünschten Zelltyp steuern. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie Gro-Maus-embryonale Stammzellen in 10 cm Zellkulturschalen mit Maus-ES-Zellmedium, das mit Faktor zur Hemmung der Leukämie ergänzt ist, kultivieren. Wenn die ES-Zellen eine Konfluenz von 50 bis 70 % erreicht haben, sind sie gebrauchsfertig.

Entfernen Sie das ES-Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit fünf Millilitern steriler PBS. Geben Sie zwei Milliliter 0,05 %iger Trypsin-EDTA-Lösung pro Platte hinzu und inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius für drei bis fünf Minuten. Danach stoppen Sie die Trypsin-EDTA-Wirkung durch Zugabe von je drei Millilitern ES-Medium pro Platte und überführen Sie die Zellen in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Bei 1000 Umdrehungen pro Minute drei Minuten lang zentrifugieren. Nach der Zentrifugation das Überstand entfernen und das Zellenpellet mit der gewünschten Menge EB-Medien resuspendieren. Die Zellanzahl bestimmen und anschließend die Zellen auf fünf mal 10 hoch drei Zellen pro Milliliter verdünnen.

In EB-Medien mit einer Mehrkanalpipette 100 Mikroliter EB-Medien, die Zellen enthalten, in jedes Loch einer 96-Rundboden-Mikrotiterplatte geben. Die Anzahl der benötigten 96-Loch-Platten hängt von der Anzahl der Bedingungen und Zeitpunkte des Experiments ab. Die 96-Rundboden-Mikrotiterplatten in einen befeuchteten 37 °C warmen 5 % CO₂-Inkubator stellen, um kritische Zeitfenster wichtiger Signalwege für die Kardiogenese zu identifizieren.

Modulatoren spezifischer Signalwege werden den ES-Zellen hinzugefügt. In die Rundbodenmikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen werden die in Medium verdünnten Signalwegmodulatoren zu verschiedenen Zeitpunkten in jede Vertiefung gegeben. Die Hälfte der Vertiefungen jeder 96-Loch-Platte wird für jeden Behandlungsbeginn verwendet.

Einer Kontrolle mit Fahrzeuglösung werden jeweils für jeden Zeitpunkt die anderen 48 Vertiefungen hinzugefügt. An verschiedenen Endpunkten werden wir die Signalmoleküle durch Mediumwechsel aus jeder Vertiefung auswaschen, wobei besondere Vorsicht geboten ist, um die embryonalen Körperchen nicht zu stören. An verschiedenen Zeitpunkten erfolgt das Auswaschen der Modulatoren durch Erneuern des EB-Mediums in den Vertiefungen. Kippen Sie die 96-Loch-Platte um etwa 10 Grad und entfernen Sie vorsichtig das Medium aus den Vertiefungen mit einer Mehrkanalpipette.

Gegeben Sie anschließend EB-Medien ohne Modulator zu jedem Brunnen hinzu, wenn die Behandlung länger als 48 Stunden dauert. Ersetzen Sie die mit frischen Modulatoren angereicherten EB-Medien alle zwei Tage, bis der gewünschte Endzeitpunkt erreicht ist. Untersuchen Sie sieben Tage nach Induktion der EBS durch Übertragung der ES-Zellen in 96-Well-Platten die EB-Kontraktion unter dem Mikroskop.

Bewerten Sie die Vertiefungen mit kontrahierenden EBS als positive Ergebnisse, um die Prozentsätze kontrahierender EBS für jeden unterschiedlichen Behandlungszeitverlauf zu erhalten. Die durch die 96-Loch-Platten-Experimente identifizierten Zeitfenster der Signalübertragung für die Kardiogenese können an EBS überprüft werden, die aus hängenden Tropfen hergestellt wurden, um hängende EBS-Tropfen zu erzeugen. Bereiten Sie zunächst Petrischalen vor, indem Sie drei bis vier Milliliter PBS hinzufügen, um später eine Verformung der Tropfen zu verhindern.

Als Nächstes wird eine ES-Zellsuspension, die eine Enddichte von 2,5 × 10⁴ Zellen pro Milliliter aufweist, in eine Bakterienschale gegeben, um einen einfachen Zugang zu ermöglichen. Mit einer Mehrkanalpipette werden 20-μl-Tropfen der ES-Zellen auf die umgedrehten Deckel der Petrischalen appliziert. Dabei dürfen die einzelnen Tropfen einander nicht berühren.

Im Allgemeinen kann ein Deckel bis zu 80 Tropfen aufnehmen. Danach den Deckel umdrehen und über die Petrischale mit PBS legen, und 48 Stunden in einem 37 °C warmen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid inkubieren, um die Bildung von EBs zu ermöglichen. Nach 48 Stunden die aus hängenden Tropfen gebildeten EBs von jedem Deckel mit drei Milliliter EB-Medium abwaschen.

Ziehen Sie zwei Deckel von EBS in eine neue Petrischale. Inkubieren Sie die Petrischale vier Tage lang in einem 37 °C warmen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Am vierten Tag übertragen Sie die EBS in Suspension auf mit 0,2 % Gelatine beschichtete Sechs-Well-Platten. Jeweils 30 EBS werden in jede Vertiefung übertragen und mit Signalmolekülen inkubiert, und zwar zu dem Zeitpunkt, der in den Experimenten mit 96-Well-Platten ermittelt wurde, sieben Tage nachdem die hängenden Tropfen hergestellt wurden.

Beobachten Sie die EBs unter dem Mikroskop auf Kontraktion. ES-Zellen, die in den runden Bodenmulden einer 96-Loch-Platte kultiviert werden, bilden EBs, wie in diesem repräsentativen Bild eines am vierten Tag gebildeten EBs dargestellt. Die entscheidenden Zeitpunkte für die ES-Kardio-Genese sind die Zeitfenster, die im Vergleich zur Fahrzeugkontrolle den höchsten Prozentsatz an kontrahierenden EBs aufweisen, nach Behandlung mit Signalmolekül-Modulatoren. Gezeigt ist hier ein spontan kontrahierender Fokus von Kardiomyozyten, der sich aus dorsomorphinbehandelten ES-Zellen am Tag 10 der Differenzierung in einer 96-Loch-Mikrotiterplatte gebildet hat.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man effizient kritische zeitliche Regulationsmechanismen und zeitliche Fenster wichtiger Signalwege in der ES-Kardio-Genese identifiziert.