Lipidvesikel-vermittelte Affinitätschromatographie unter Verwendung von Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): Eine neue Methode zur Protein-Lipid-Wechselwirkungen Analyze

Dieses Experiment dient der Identifizierung von Lipid-bindenden Proteinen und der Analyse der Wechselwirkung zwischen Lipiden und Proteinen in einer definierten Membranumgebung. Proteine von Lipid-Schichten aus Zellhomogenat werden mit frisch hergestellten Lipidvesikeln aus Phosphatidylserin und Ceramid inkubiert. Anschließend wird das Reaktionsgemisch mit an magnetische Kügelchen konjugiertem Xin V ergänzt, um die an die Lipidvesikel gebundenen Proteine an den magnetischen Kügelchen zu verankern. Danach werden die Protein-Lipid-Vesikel mittels magnetischer Aktivierungszellseparation gereinigt.

Um das lipidgebundene Protein anhand der dargestellten Ergebnisse zu identifizieren, verwenden Sie die SDS-Page-Western-Blotting-Methode, um die Lyx-Reinigung endogener und rekombinanter atypischer PKC sowie einer spezifischen Ceramid-bindenden Domäne nachzuweisen, die in MDCK-Zellen exprimiert sind. Der Hauptvorteil dieser neuartigen Technik gegenüber bestehenden Methoden wie ELISA oder Plasmonenresonanzspektroskopie zur Oberflächenbindung besteht darin, dass die Lipid-Protein-Interaktion in einer membranähnlichen Umgebung erfolgt und dass die bindenden Proteine gereinigt und analysiert werden können. Die Implikationen dieser Technik reichen bis hin zur Therapie und Diagnose von Erkrankungen, an denen Lipide beteiligt sind, da bei diesen Krankheiten die physiologische Lipid-Protein-Interaktion gestört ist.

Für einige dieser Erkrankungen sind die Proteinziele noch nicht einmal bekannt und müssen erst identifiziert werden. Um eine lipidbasierte Therapie zu entwickeln, beginnen Sie mit Lipid-SLs, die aus einem getrockneten Gemisch äquimolarer Mengen von Phosphatidylserin und C16-Ceramid in 100 Mikroliter sical-Puffer hergestellt wurden. Sonoziert nach Zugabe von 300 Mikroliter iCal-Puffer, ergänzt mit 0,1 Millimolar Mangan(II)-chlorid, eine Stunde lang, zentrifugiert die Proben bei 12.000 × g für 20 Minuten bei vier Grad Celsius und resuspendiert dann das Pellet aus großen Lipidvesikeln in 100 Mikroliter sical-Puffer. Gebt einen Nanomolar des fluoreszierenden Farbstoffs vibrant cm DII zu und inkubiert eine Stunde bei 37 Grad Celsius, um die Visualisierung des SLE-Fraktion nach der Max-Trennung zu erleichtern. Gewinnt durch Zentrifugation ein rosa Pellet aus dem mit vibrant cm DII gefärbten Phosphat, einem syrischen Ceramid-SLs, und resuspendiert es in 100 Mikroliter Tris-Puffer.

Als Nächstes, um ein detergentfreies Zelllysat herzustellen, zentrifugieren Sie die Zellen in 300 Mikrolitern hypertonischem Puffer aus 10 Millimolar Tris, Wasserstoffchlorid, das Protease- und Phosphatasehemmer enthält, und zentrifugieren Sie. Um membranösen Zelltrümmer zu entfernen, geben Sie nun das klare Zelllysat zu der lipidphysikalischen Suspension hinzu und inkubieren Sie das Gemisch zwei Stunden bei vier Grad Celsius. Da Zelllysate endogene Membranen mit Phosphatidylserin enthalten können, wird empfohlen, das Lysat durch zusätzliche Zentrifugationsschritte von diesen Membranen zu befreien.

Supplementieren Sie das Reaktionsgemisch mit 20 Mikrolitern eines XNV-Bindungspuffers und 50 Mikrolitern einer Lösung, die magnetische Kügelchen enthalten, die mit einem XNV konjugiert sind; inkubieren Sie eine Stunde bei vier Grad Celsius und führen Sie die magnetisch aktivierten Zellsortierung gemäß der Herstelleranleitung durch. Überwachen Sie anschließend die lebhafte CM-DII-Fluoreszenz in den Durchlauf- und Elutionsfraktionen mittels eines Mikroplatten-Fluoreszenzlesers, um das Vorhandensein und die Menge von Lipid-Les in einem Antikörper-Konkurrenz-Assay zu bestimmen. Um die Spezifität der Bindungsreaktion von A PKC an die Ceramid-Phospho-Sein-Vesikel zu überprüfen, inkubieren Sie ein Mikrogramm des anti-PKC-Zeta-Kaninchen-polyklonalen Antikörpers mit einem Zelllysat eine Stunde bei vier Grad Celsius, gefolgt von einer Inkubation mit den Lipidvesikeln.

Fahren Sie mit der SDS-Page und der Immunoblot-Analyse der Proteingebundenheit an die Ceramidphosphat-Serin-Schleifen im Max-Eluat für die in-vitro-Rekonstitution eines Lipid-Protein-Polaritätskomplexes fort. Beginnen Sie mit der Zubereitung eines rosa Pellets aus lebhaft gefärbten cm-DII-markierten Phosphat-Serin-Ceramid-Vesikeln, wie zuvor gezeigt. Resuspendieren Sie die Vesikel in 100 Mikroliter Tri-Puffer, ergänzt mit 100 Mikromolar γ-S-GTP, einem Millimolar GDP und einer Kombination aus rekombinanten Proteinen des Interesses. Inkubieren Sie die Reaktion dann drei Stunden lang bei vier Grad Celsius. Geben Sie anschließend fünf Mikroliter einer 20-fach konzentrierten X-in-V-Pufferlösung und 50 Mikroliter X-in-V-konjugierter magnetischer Bärtchen hinzu.

Die Mischung weitere 30 Minuten unter leichtem Rühren bei vier Grad Celsius inkubieren. Führen Sie die magnetische Aktivierungszellseparation mit NX NV gemäß den Empfehlungen des Herstellers durch, um die Präzipitation zu unterstützen. Ergänzen Sie die Elutionsfraktion mit 10 Mikrogramm reinem e-Albumin.

Konzentrieren Sie die Proteine durch Weyl-Flue-Fällung. Die untere Phase besteht aus Chloroform-Methanol mit angereichertem, lebhaftem cm dii. Die bräunliche Zwischenphase enthält die magnetischen Perlen und das gefällte Protein.

Quantifizieren Sie die Ellu-Lipidvesikel durch Nachweis von rosa, intensivem CM-DII in der organischen Chloroform-Methanol-Phase der Weyl-Flu-Reaktion. Verwenden Sie gleiche Mengen an Lipidvesikeln, um die Proteinmengen zwischen den Proben zu normalisieren, und analysieren Sie mittels SDS-PAGE. Immunoblotting.

Ein lysatfreier Lysat von MDCK-Zellen, die ein vollständiges PKC-Zetta exprimieren, das C-terminal mit einem grünen fluoreszierenden Protein oder einer Ceramid-bindenden Domäne verknüpft ist. Im C-Terminus von PKC-Zetta wurde mit Phosphoserin inkubiert.

Ceramid-Vesikel nach der Eluierung der Max-Säule wurden die Proteine durch Immunspeicherung analysiert. Das Ceramid-bindende Fragment C 20 Zeta, EGFP und die vollständige Länge von P KC Zeta wurden aus dem EIT der Max-Säule gewonnen, was mit der Spezifität und Wirksamkeit des lyx-Verfahrens übereinstimmt. Die negative Kontrolle EGFP, die nicht an Phosphat bindet, war in unseren syrischen Ceramid-Vesikeln im EIT nicht nachweisbar.

Wenn Linx mit anderen Methoden wie SDS-Gelelektrophorese und Western Blotting oder proteomischen Analysen kombiniert wird, können zusätzliche Fragen beantwortet werden, beispielsweise welche Proteine im lipidbindenden Protein-Komplex enthalten sind. Nach seiner Entwicklung hat LabX Forschern auf dem Gebiet der Einzel-Lipid-Forschung den Weg geebnet, die ceramidinduzierte Apoptose sowie die Zellpolarität in neuronalen Stammzellen und epithelialen Zellen zu untersuchen.