High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Umweltproben

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, enzymatisch hydrolysiertes organisches Phosphor in Extrakten von Boden- oder Gülleproben zu klassifizieren. Dies wird erreicht, indem die Proben zunächst mit einer Natriumhydroxid-EDTA-Lösung extrahiert und der pH-Wert der Extrakte angepasst wird. Anschließend werden diese angepassten Extrakte mit zwei verschiedenen Enzymlösungen inkubiert.

Auf einer 96-Well-Platte erfolgt im letzten Schritt die Messung des enzymatisch freigesetzten orthophosphats mittels Molybdänblau-Farbmessung. Letztendlich können die meisten nativen Formen von orthophosphatmonoestern und -diestern im Hinblick auf Phosphor in Boden- oder Gülleproben basierend auf der differentiellen Freisetzung von Orthophosphat durch die enzymatische Hydrolysemethode klassifiziert werden. Diese Methode kann kostengünstig in jedem Standardlabor durchgeführt werden.

Der Hauptvorteil gegenüber bestehenden Methoden wie der Phosphor-31-Kernspinresonanzspektroskopie besteht darin, dass diese Methode das Potenzial einheimischer Bodenenzyme messen kann, Orthophosphat künftig aus organischen P-Verbindungen freizusetzen. Die mit dieser Methode gewonnenen Daten können daher helfen, die Bodenfruchtbarkeit oder das Potenzial des Bodens vorherzusagen, schädliche Mengen algenverfügbares Orthophosphat freizusetzen. Geben Sie 30 Milliliter der 0,25-molaren Natriumhydroxidlösung zu zwei Gramm feuchter oder getrockneter Probe in einem 50-Milliliter-Kegelrohr hinzu.

Unter Schütteln 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren. Die Proben 30 Minuten bei 3000 ×g zentrifugieren und anschließend 100 Mikroliter in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen, das bereits Acetatpuffer enthält. Die adjustierte Probe hat ein Gesamtvolumen von einem Milliliter und einen pH-Wert von 5,0.

Bereiten Sie zwei Stammlösungen mit 0,5 Einheiten pro Milliliter Säurephosphatase in 10 Milliliter frisch hergestelltem 0,1-molarer Natriumacetat-Puffer mit pH 5 vor. Geben Sie nun rekonstituierte lyophilisierte Nuklease NP 1 aus Penicillium Citrin in eines der 10-Milliliter-Röhrchen mit Säurephosphatase-Stammlösung, um eine Endkonzentration von 2,5 Einheiten NP 1 pro Milliliter zu erreichen, und mischen Sie vorsichtig durch mehrmaliges Umstülpen. Zentrifugieren Sie die beiden Enzymlösungen bei 3000 ×g für 30 Minuten. Um eine Kalibrierkurve aufzustellen, geben Sie zunächst ein Milliliter einer einmillimolaren Kaliumphosphat-Stammlösung in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und führen Sie sieben 0,5-Milliliter-Verdünnungen durch, wobei das erste Röhrchen verworfen wird, sodass die endgültige Verdünnungsreihe von 20 µl bis 0,625 nm Phosphor reicht.

Übertragen Sie nun die ORTHOPHOSPHAT-Standards in die letzten beiden Spalten der Platte, beginnend mit null nm Orthophosphat in Reihe A und endend mit 20 nm Orthophosphat in Reihe H auf die ersten drei Vertiefungen der Spalte 10. Geben Sie 40 Mikroliter PP-plus-GP-Enzymlösung in die nächsten drei Vertiefungen der Spalte 10. Geben Sie 40 Mikroliter PP-plus-GP-plus-NP-Ein-Enzymlösung hinzu.

Fügen Sie abschließend 40 µL Puffer mit 100 mM Acetat zu allen sechs Vertiefungen hinzu. Nun sollte jede der ersten sechs Vertiefungen in Spalte 10 80 µL Lösung enthalten, die auf die nächsten beiden Vertiefungen übertragen werden. Geben Sie 40 µL Natriumacetatlösung mit 10 M Glukose, sechs Phosphat und 40 µL PP plus GP-Enzymlösung hinzu.

Für jede zu testende Probe verteilen Sie 40 Mikroliter der pH-adjustierten Probenextrakte auf die Vertiefungen eins bis neun in bis zu acht Reihen, nachdem alle Proben verteilt wurden. Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um die PP-plus-GP-Enzymlösung auf die Spalten eins bis drei, PP plus GP plus NP auf die Spalten vier bis sechs und 0,1-molare Natriumacetatpufferlösung auf die Spalten sieben bis neun zu verteilen. Führen Sie diesen Schritt rasch durch, um sicherzustellen, dass alle Proben eine gleichlange Inkubationszeit erhalten.

Decken Sie die 96-Well-Platte mit einem Deckel ab und inkubieren Sie die Proben, Enzymlösungen, Kontrollen und die Kalibrierkurve genau eine Stunde bei 37 Grad Celsius in entionisiertem Wasser. Bereiten Sie jeweils 50 Milliliter von vier Stammlösungen vor. Lösung A muss täglich unter Verwendung einer Mehrkanalpipette schnell hergestellt werden.

Fügen Sie 25 µL SDS, 100 µL Lösung A, 20 µL Lösung B und 50 µL Lösung C in alle Vertiefungen der 96-Well-Platte hinzu, decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur. Messen Sie abschließend die Absorption bei 850 Nanometern in einem beliebigen, programmierbaren Mikroplattenreader mithilfe einer Tabellenkalkulationsanwendung.

Zunächst wird die Kalibrierungskurve für anorganischen Phosphor mit 0 bis 20 Nanomol Phosphor auf der X-Achse und dem Mittelwert der duplizierten Absorptionsmessungen auf der Y-Achse aufgetragen, eine lineare Regression durchgeführt und die Gleichung der Ausgleichsgeraden ermittelt. Anschließend berechnen Sie den Hintergrundgehalt an anorganischem Phosphor, indem Sie die Werte der Spalten eins bis drei mitteln und dann die Kalibrierungskurve auf den Datensatz anwenden. Um den aus hydrolysierten Phosphormonoestern stammenden Phosphor zu bestimmen, mitteln Sie die Triplicate der Probenwerte aus den Spalten vier bis sechs und ziehen die Kontrollenzymlösung sowie den Hintergrundgehalt an anorganischem Phosphor ab.

Dann berechnen die DERs den Gehalt an Phosphor aus hydrolysiertem Phosphor, indem sie die Werte der dreifachen Proben aus den Spalten sieben bis neun mitteln und die Kontrollenzymlösung sowie den Hintergrund an anorganischem Phosphor und den hydrolysierten Monoester-Phosphor aus den Spalten vier bis sechs subtrahieren. Eine typische 96-Well-Platte zeigt Ergebnisse für acht Proben und eine Kalibrierungskurve. Die Kontrollen befinden sich in Spalte 10.

Die Zunahme der Farbintensität zwischen den Spalten eins bis drei und vier bis sechs ist auf hydrolysierte Monoester-Phosphorverbindungen zurückzuführen, während die Zunahme zwischen den Spalten vier bis sechs und sieben bis neun auf hydrolysierte Diester-Phosphorverbindungen zurückzuführen ist. Hier wurde die Methode der Hochdurchsatz-enzymatischen Hydrolyse erfolgreich angewendet, um die Verteilung der Phosphor-Klassen in einem 0,25 molarer Natriumhydroxid- und 0,05 molarer EDTA-Extrakt einer Bodenprobe aus Vermont zu analysieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man native Orthophosphate, Monoester- und Diester-Phosphorverbindungen in Boden- oder Gülleextrakten mittels enzymatischer Hydrolyse bestimmen kann.

Diese Technik könnte dazu beitragen, Forschenden auf den Gebieten der Umweltchemie und Nährstoffmanagement den Weg zu ebnen, um das Verhalten von organischem P in Boden- oder Güllesystemen zu untersuchen.