Charakterisierung Bakterielle Flüchtige mit Secondary Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie (SESI-MS)

Die Sekundäre Elektrospray-Ionisation, Massenspektrometrie oder CS EMS ermöglicht die Analyse bakterieller flüchtiger Substanzen, ohne dass eine Probenvorbehandlung erforderlich ist. Der Kopfraum der Bakterienkultur wird durch Kohlendioxid in die CS EI-Reaktionskammer verdrängt. Während die flüchtigen Substanzen die SSI-Reaktionskammer durchlaufen, passieren sie die Elektrospray-Wolke und werden ionisiert.

Nach der Ionisierung werden die flüchtigen Substanzen zur Analyse in das Massenspektrometer gezogen. Überschüssiges Trägergas und inaktive bakterielle flüchtige Substanzen werden durch einen 0,22-Mikron-Filter geleitet, um bakterielle Agentien als zusätzliche Schutzmaßnahme zu entfernen, und anschließend in eine chemische Abzugshaube abgeleitet. Letztendlich liefert dieses CSI-MS-Protokoll innerhalb weniger Minuten charakteristische Profile bakterieller flüchtiger Substanzen.

Wir erwarten, dass diese Technologie in vielen Anwendungen eingesetzt werden könnte, einschließlich der Analyse ausgeatmeter Luft, der Atemanalyse bei Infektionskrankheiten oder sogar in Lebensmittelsystemen, wo wir möglicherweise Krankheitserreger auf oder in unseren Lebensmitteln schnell nachweisen könnten. Diese Methode bietet mehrere wesentliche Vorteile gegenüber bestehenden Verfahren wie GCMS, MS und PT, RM S. Zunächst erfordern die flüchtigen Stoffe keine Vorbehandlung vor der Analyse.

Zweitens können spezifische Ionen in der flüchtigen Mischung fragmentiert werden, was die Identifizierung der Verbindungen erleichtert. Und drittens ist es schnell. Typischerweise dauert es weniger als fünf Minuten.

Um jede Probe zu analysieren, wählen Sie das geeignete Gefäß für das Kultivieren Ihrer Kultur unter Berücksichtigung der Wachstumsbedingungen der Art sowie der effizienten Zufuhr flüchtiger Stoffe zum Massenspektrometer. In dieser Demonstration haben wir standardmäßige Pyrex-Medienflaschen mit einem Fassungsvermögen von 100 Milliliter ausgewählt. Die bakteriellen flüchtigen Stoffe werden durch einen Strom von Trägergas zum Massenspektrometer geleitet, um den Trägerstrom aufzubauen.

Gasleitungen passen auf die Kulturflaschen mit Gewindeverschlüssen, die mindestens zwei Luer-Anschlüsse aufweisen. Führen Sie die Gaszufuhr- und -abfuhrleitungen durch die Luer-Anschlüsse ein und verschließen Sie alle zusätzlichen Anschlüsse, bevor Sie Ihre Proben kultivieren. Drücken Sie die Gefäße an und tauchen Sie sie zur Überprüfung auf Dichtheit ins Wasser ein.

Gaslecks sind eine Hauptursache für atypische Ergebnisse in Form von schwachen oder fehlenden Signalen. Flüchtige Ionensignale verstärken sich über Nacht. Kulturen von E. coli, K 12, und Pseudomonas aeruginosa, PAO1, in LB Lennox, wobei zwei biologische Replikate für jede Art vorbereitet werden.

Bereiten Sie neun sterile Kulturgefäße mit jeweils 50 Milliliter LB-Lennox und ein nicht inoculiertes Gefäß vor, das als Blindansatz dient. Inoculieren Sie jede Übernachtkultur in zwei Probengefäße, um technische Replikate zu erstellen. Inkubieren Sie die Kulturen und den Blindansatz 24 Stunden bei 37 Grad Celsius. Da das CEMS speziell zur Probenahme flüchtiger Substanzen konzipiert ist, beschränken Sie die Verwendung duftender Körperpflegeprodukte vor der Gerätebenutzung streng.

Verschließen Sie alle flüchtigen Chemikalien im Labor und kontrollieren Sie Luftzug so weit wie möglich während der Tests, um eine Kontamination Ihres Instruments und der Gasübertragungsleitungen zu verhindern. Bei lebensfähigen biologischen Agentien installieren Sie Filter mit der geeigneten Porengröße in die Trägergasleitung. Die Filter beeinträchtigen nicht die Übertragung flüchtiger Substanzen in die SESI-Reaktionskammer, können jedoch die Effizienz der Aerosolübertragung leicht beeinträchtigen.

Um zu überprüfen, dass die Spannungsversorgung ausgeschaltet ist und das System von elektrischer Ladung entladen wurde, kontrollieren Sie, ob die Anzeigelampen am Spannungsversorger aus sind. Stellen Sie sicher, dass die Spannung am Multimeter null beträgt, und erden Sie die elektrischen Leitungen. Befüllen Sie zu diesem Zeitpunkt die Elektrospray-Lösung zur Analyse.

Im positiven Ionenmodus verwenden wir eine Elektrospray-Lösung aus 0,1 % Ameisensäure, 5 % Methanol und 94,9 % Wasser. Um eine optimale Signalintensität und -stabilität zu erreichen, schalten Sie das Trägerventilgas Kohlendioxid ein und stellen Sie die Durchflussrate auf zwei Liter pro Minute ein. Üben Sie Druck auf das Elektrospray-Reservoir aus, um die Zufuhr der Elektrospray-Lösung in die Reaktionskammer mit einer Durchflussrate von fünf Nanolitern pro Sekunde zu starten. Schalten Sie anschließend die Spannungsquelle ein und stellen Sie die Spannung auf 2,5 Kilovolt ein.

Die angelegte Spannung beeinflusst die Signalionenintensität und die Stabilität des Elektrospray-Tailorkonus; für unser System liefern Spannungen zwischen zwei und fünf Kilovolt die besten Ergebnisse im positiven Ionenmodus. Vorsicht ist geboten, da an dieser Stelle die metallischen Oberflächen der Ionisationsquelle einen gefährlichen elektrischen Schlag verursachen können. Richten Sie nun eine Abstimmungsmethode zur Überwachung des SEMS-Spektrums ein.

Deaktivieren Sie das Kontrollkästchen für die Mehrkanal-Aufnahme (MCA). Stellen Sie die Aufnahmezeit auf 10 bis 15 Minuten ein und starten Sie die Datenaufnahme. Beobachten Sie die Spektren des Trägergas-Hintergrunds und nehmen Sie feine Justierungen der angelegten Spannung vor, um ein stabiles Gesamtionenchromatogramm und reproduzierbare Scans zu erhalten.

Setzen Sie die Aufnahme von Spektren und A TIC fünf Minuten lang fort, um sicherzustellen, dass das Instrument stabilisiert ist und ordnungsgemäß versiegelt ist. Geben Sie die Erfassungsparameter entsprechend Ihrem Experiment ein. Nehmen Sie ein Hintergrundspektrum des Trägergases für zukünftige Experimente auf.

Um ein Blind-Spektrum aufzunehmen, leiten Sie den Trägergasstrom durch die Bypass-Leitungen und schließen Sie anschließend die Blindprobe mit geschlossenen Ventilen an die Transferleitungen des Geräts an. Öffnen Sie die Ventile zur Probenflasche und schließen Sie die Ventile der Bypass-Leitungen.

Für reproduzierbare Spektren. Lassen Sie das System 30 Sekunden lang äquilibrieren, während die Luftfeuchtigkeit in der Reaktionskammer stabilisiert wird. Um sicherzustellen, dass das System äquilibriert ist, überwachen Sie die TIC, die während der Äquilibrationsphase variiert und anschließend stabil bleibt.

Wenn das System im Gleichgewicht ist, starten Sie die Spektrumserfassung. Nachdem das Spektrum erfasst wurde, entfernen Sie die Probenflasche, indem Sie zunächst die Bypass-Leitungen des Trägases öffnen und anschließend die Probenventile schließen.

Und schließlich die Probenflasche entfernen. Spülen Sie das System zwei bis vier Minuten lang mit dem Trägergas, um Feuchtigkeit und adsorbierte flüchtige Stoffe aus den Transferleitungen zu entfernen und eine Übertragung zwischen den Proben zu verhindern. Sammeln Sie intermittierend flüchtige Fingerabdruckdaten für jede Bakterienprobe und erfassen Sie zusätzlich immer wieder Blindwerte, um eine gründliche Subtraktion der Blindwerte sicherzustellen.

Die flüchtigen Fingerabdrücke im Positiv-Ionen-Modus für E. coli und P. aeruginosa, die aerob in LB-Lennox-Medium 24 Stunden bei 37 Grad Celsius gezüchtet wurden, sind unterschiedlich. Das flüchtige Spektrum von E. coli wird durch ein Signal bei einem Masse-zu-Ladungs-Verhältnis von 118 dominiert, während das Spektrum von Pseudomonas aeruginosa eine größere Vielfalt an proteinassoziierten Peaks aufweist.

Während Sie dieses Verfahren durchführen, ist es wichtig, dass Sie die für Ihre Analyse optimierten instrumentellen Parameter dokumentieren, wie beispielsweise die angelegte Spannung, die Zusammensetzung der Elektrosprüh-Lösung und die Strömungsgeschwindigkeit des Trägergases. Ebenso wichtig ist es, Aufzeichnungen Ihrer repräsentativen Spektren zu führen, damit Sie Ihre Analysen in Zukunft reproduzieren können. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit pathogenen Bakterien und Hochspannung äußerst gefährlich sein kann.

Daher sollten stets Vorsichtsmaßnahmen wie die Beschränkung des Zugriffs auf das css-CMS während des Experiments getroffen werden. Nun sollten Sie in der Lage sein, reproduzierbar ein CSS- und EMS-Spektrum für die bakteriellen flüchtigen Stoffe in Ihrem System zu erhalten. Viel Erfolg.