Silizium-Mikrochips zur Manipulation Zell-Zell-Interaktion

Hallo, ich bin Elliot Hu. Ich bin Postdoktorand in Tias Labor am Massachusetts Institute of Technology. Heute werden wir Zellkulturen auf siliziumbasierten mikromechanischen Chips vorbereiten. Die Geräte sehen aus wie kleine Kämme, die ineinander greifen, und ermöglichen es uns, die Wechselwirkungen zwischen zwei verschiedenen Zellpopulationen präzise zu steuern.

Heute werden wir die Wechselwirkung zwischen Leberhepatocyten und unterstützenden Stromazellen untersuchen. Insbesondere werden Drei-T-Drei-Fibroblasten auf der Oberseite der Kämme kultiviert, sodass man durch Verschieben der Kammzinken die Zellen bewegen und ihre räumliche Anordnung verändern kann. Jedes Gerät ist in zwei Teile unterteilt, die in zwei möglichen Konfigurationen zusammenrasten.

Die erste Variante bringt die beiden Zellpopulationen in direkten Kontakt miteinander. Die zweite Variante trennt die beiden Populationen leicht voneinander, sodass die Zellen sich nicht berühren können. Hier werden Kontaktkommunikationen verhindert, aber Interaktionen über sezernierte Faktoren erhalten.

Beginnen wir mit der Erläuterung, wie man die Teile mit einer Pinzette handhabt. Ich verwende gerne sowohl größere Teflon-Pinzetten als auch kleinere Metallpinzetten mit abgerundeter Spitze. Mit den größeren Pinzetten kann man die Teile an den Kanten so anfassen; bei größeren Stücken mit Armen muss man darauf achten, die Arme nicht zu beschädigen, da sie sehr zerbrechlich sind.

Man möchte sie also an der Rückseite des Bauteils wie folgt aufnehmen. Mit der Metallpinzette kann man in das Loch hineinreichen und die Chips direkt aufnehmen. Die größeren Bauteile passen in eine Wandung einer 12-Loch-Platte, während die kleineren Bauteile entweder in eine 24-Loch-Platte passen oder mit dem größeren Bauteil kombiniert werden können.

In einer 12-Loch-Platte verwende ich normalerweise die Metallpinzette. Wenn ich die Teile in den Platten zusammenstecke, lege ich gewöhnlich zuerst das größere Teil in die Vertiefung und schiebe es ganz an eine Seite. Dann nehme ich das passende Reparaturteil und lege es auf die gegenüberliegende Seite der Vertiefung, und schiebe beide Teile zusammen, indem ich jeweils eine Pinzette in jedes Loch einführe.

Jetzt kann ich die Teile entweder in der Spaltkonfiguration oder in der Kontaktkonfiguration einfach verriegeln. Wenn ich die Teile wieder trennen möchte, ziehe ich sie gerne zunächst in die Spaltkonfiguration und dann senkrecht nach oben, um das Teil zu entfernen. Die Vorrichtungen bestehen aus Silizium, daher müssen sie beschichtet werden, um eine geeignete Zelladhäsion zu ermöglichen.

Sie erhalten die Geräte vermutlich bereits mit Polystyrol beschichtet und plasma-behandelt, daher gehen wir davon aus, dass dies unser Ausgangspunkt ist. Zunächst beschichten wir die Oberfläche, an der die Hepatozyten haften sollen, mit Kollagen. Dazu geben wir die Hepatozytenkämme in eine Lösung mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Kollagen und inkubieren sie 45 Minuten bei 37 °C.

Die Fibroblastenkämme hingegen müssen wir nicht beschichten. Nach der Inkubation saugt man die Kollagenlösung ab und wäscht mit Wasser. Nun bringen wir die ES unter Kontakt mit komplementären Teilen zusammen, sodass eine ebene Fläche für die Zellansaat entsteht.

Zunächst füllen wir einige Vertiefungen mit 70 % Ethanol. Ich lege jeweils ein Paar in jede Vertiefung und verriegele sie anschließend miteinander. Nach dem Verriegeln betrachten wir die Teile unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie koplanar sind.

Gelegentlich können sich die Teile falsch ausgerichtet verbinden. Unter dem Mikroskop sehen Sie, dass sie sich in zwei verschiedenen Fokusebenen befinden. In diesem Fall trennen Sie die Teile einfach und drücken sie erneut zusammen. Nachdem Sie überprüft haben, dass die Ausrichtung korrekt ist, lassen Sie die Teile eine Weile in Ethanol, um sie zu sterilisieren.

Oft habe ich es eilig und lasse daher nur 10 Minuten lang einweichen. Nach der Sterilisation müssen wir gründlich abspülen. Das Ethanol vollständig abpipettieren und mit Wasser waschen, dann erneut abpipettieren und erneut mit Wasser waschen, und schließlich das Wasser abpipettieren und durch Ihr Kulturmedium ersetzen.

Jetzt säen wir Zellen auf die Geräte aus. Üblicherweise suspendieren wir die Zellen in einer Konzentration von 500.000 Zellen pro Milliliter und pipettieren mithilfe einer 12-Loch-Platte je ein Milliliter Suspension über jedes Kamm-Paar. Somit haben wir die Fibroblasten in zwei der Löcher mit 500.000 Zellen pro Milliliter ausgesät.

Ähnlich dazu haben wir eine Suspension von 500.000 Hepatozyten pro Vertiefung genommen und sie in die anderen beiden Vertiefungen ausgesät. Vor der Inkubation schütteln wir die Zellen nun gründlich, um sicherzustellen, dass sie gleichmäßig verteilt sind. Ich schüttele dazu dreimal vertikal, dreimal horizontal und wiederhole dies insgesamt dreimal.

Nach dem Schütteln werden wir die Probe in den Inkubator stellen und die Zellen 15 Minuten lang ruhen lassen, danach werden wir sie erneut schütteln. Nach dem Schütteln alle 15 Minuten über eine Stunde hinweg werden wir die Zellsuspension anschließend abpipettieren und mit einer neuen Zellsuspension fortfahren. Dies werden wir wiederholen, bis wir eine konfluente Zellschicht erhalten haben.

Bei Fibroblasten dauert es in der Regel eine oder zwei Belegungen. Bei Hepatozyten können zwei bis vier Belegungen erforderlich sein. Um eine konfluente Monoschicht zu erhalten, werden die Zellen mit einer relativ hohen Dichte ausgesät; das Schütteln stellt sicher, dass die Zellen gleichmäßig verteilt werden.

Nach der ersten Ansiedlung bildet sich eine dünne Zellschicht. Beachten Sie, dass die Zellen nur an den Fingern haften, die mit Polystyrol und Kollagen beschichtet wurden. Nach erneutem Ansäen frischer Zellen und einer weiteren einstündigen Inkubation, wiederum mit Schütteln alle 15 Minuten, wird die Zellschicht dichter.

Nach der dritten Aussaat haben wir eine gute Zelldichte erreicht und können nun anhalten, nachdem die Zellen auf die Kämme ausgesät wurden. Wir möchten die Zellen in die gewünschte experimentelle Anordnung bringen. Die Geräte werden nun von ihren komplementären Teilen getrennt und für 24 Stunden inkubiert.

Nach 24 Stunden haben sich die Zellen ausgebreitet und bilden eine konfluente Monoschicht auf der Oberfläche der Kämme. Nun soll eine Ko-Kultur angelegt werden. Der Hepatozytenkamm und der Fibroblastenkamm werden jetzt in dasselbe Well überführt und in der gewünschten Anfangskonfiguration miteinander verriegelt.

Falls gewünscht. Nach einer bestimmten Zeit kann die Konfiguration geändert werden. Beispielsweise können wir nach 18 Stunden zur Spaltkonfiguration übergehen, wobei die Teile in dieselbe Position gebracht und zusammengeschoben werden, bis die Spaltkonfiguration erreicht ist, und anschließend wieder in Kontakt gebracht und zurück in die Spaltkonfiguration geschoben werden.

Und jetzt werden wir ein Kamm entfernen. Was wir jetzt tun werden, ist, den alten Polystyrolüberzug abzutragen, die Chips zu reinigen und anschließend eine neue Polystyrolbeschichtung aufzubringen, um sie für die Zellkultur vorzubereiten. Indem wir erneut den alten Polystyrolüberzug entfernen und eine frische Schicht auftragen, stellen wir sicher, dass keiner der Einflüsse des vorherigen Experiments die neuen Experimente beeinträchtigen kann.

Nachdem Sie Ihr Experiment abgeschlossen haben, sollten Sie zunächst Ihre Zellen mit Bleichmittel behandeln und anschließend Ihre Kämme und das Wasser abspülen. Bevor Sie die Chips in den Toing geben, müssen Sie sicherstellen, dass sie vollständig trocken sind. Hier haben wir einige Kämme, die ich eine Weile zur Lufttrocknung beiseitegestellt habe, und überprüfe, ob sie vollständig trocken sind.

Und nun nehmen wir etwas davon und geben es in diesen Glaslautsprecher. Dazu verwenden wir eine Glaspipette, damit es sich nicht auflöst. Halloween löst Kunststoff auf, daher können wir keine typische Polystyrol-Pipette verwenden.

Okay, das sollte genügen. Nun nehmen wir einige dieser Teile, legen sie in das Toing und schalten den Shaker ein, um sie zu agitieren, und bedecken es mit Aluminiumfolie, um die Verdunstung des Toluols zu verhindern. Nach zwei Stunden sollte das Toluol den größten Teil des Polystyrols auf den Kämmen gelöst haben, sodass wir sie herausnehmen und die Kämme an der Luft trocknen können.

Nach dem Halloween-Spülen sollten die Teile weitgehend frei von Polystyrol sein und relativ sauber sein. Wir benötigen jedoch, dass die Teile äußerst sauber sind, damit die neue Polystyrolschicht gut haftet, falls sie nicht äußerst sauber sind. Das Poly-Ty neigt dazu, sich in der Mitte des Experiments abzulösen, wenn die Zellen damit beginnen, daran zu ziehen.

Was wir jetzt durchführen werden, ist eine Reinigung mit Piranha-Säure. Ich habe die Teile in ein Glasgefäß gegeben und werden dieses nun erhitzen. Dazu stellen wir es auf eine Heizplatte.

Und hier haben wir Schwefelsäure und Wasserstoffperoxid. Ich werde zuerst die Schwefelsäure hinzufügen und darauf achten, dass alle Chips vollständig unter der Flüssigkeit eingetaucht sind. Manchmal neigen sie dazu, zu schwimmen.

Und da wir jetzt mit ziemlich ätzenden Chemikalien arbeiten, stellen Sie sicher, dass Sie die richtige Schutzausrüstung tragen. Hier trage ich Nitrilhandschuhe. Nun werden wir das Wasserstoffperoxid zur Säure geben und müssen vorsichtig sein, da es sich um eine exotherme Reaktion handelt.

Sie sehen also, dass es beim Reagieren etwas raucht, aber wir wollen dem System zusätzliche Energie zuführen, um die Reaktivität weiter zu erhöhen. Nun erhitzen wir es auf etwa 120 Grad Celsius – gerade bei ein 20. Sie können also sicher sein, dass alle Rückstände Ihrer Zellkultur vollständig von Ihren Chips entfernt werden. An diesem Punkt lassen Sie die Reaktion einfach vollständig ablaufen, bis das gesamte Wasserstoffperoxid verbraucht ist.

Und an diesem Punkt wird die Mischung aufhören zu blubbern. Die Reaktion dauert also etwa eine halbe Stunde, bis sie vollständig abgelaufen ist. Sobald keine Blasen mehr zu sehen sind, können Sie die Heizplatte ausschalten und die Mischung abkühlen lassen.

Und wir werden sie in eine BAK-Kurve mit Wasser überführen. Achten Sie erneut darauf, hier Teflon-Pinzetten und nicht metallene zu verwenden, und heben Sie sie einfach auf, um sie umzusetzen. Nun spülen wir sie unter einem gleichmäßigen Strom von DDH₂O ab. Ich entnehme das Wasser normalerweise direkt aus der Leitung und lasse es hier mindestens 10 Minuten lang laufen.

Indem wir dies tun, werden wir alle Säurerückstände nach dem Zerkleinern unter fließendem Wasser für 10 Minuten abwaschen. Die Säure sollte aus den Chips entfernt werden, und wir lagern sie anschließend unter Wasser, bis wir bereit sind, das Polystyrol zu beschichten – Polystyrol mit einem Molekulargewicht von 45.000, das wir von Sigma bezogen haben. Wir werden hier eine kleine Menge davon abwiegen.

Wir haben 400 Milligramm und werden sie in Toluol bei 100 Milligramm pro Milliliter auflösen. Daher muss Toluol im Abzug gehandhabt werden. Außerdem sollten wir darauf achten, beim Auflösen von Polystyrol in Toluol keine Laborkleidung zu verwenden, die aus Polystyrol besteht.

Hier verwenden wir also Polypropylen, einen kegelförmigen Behälter und eine Glaspipette. Da ich 400 Milligramm Polystyrol habe, werde ich vier Milliliter Toluol hinzufügen. Nun werden wir die Mischung eine halbe Stunde lang vortexen, bis das Polystyrol vollständig gelöst ist. Jetzt vortexen wir das Gefäß etwa 20 Minuten bis eine halbe Stunde lang mit der niedrigsten Drehzahl.

Ich werde nun das Röhrchen an die Vortexer anschließen. Ich muss es nicht die gesamte Zeit über festhalten. Nach 20 bis 30 Minuten sollte das Polystyrol aufgelöst sein, und wir können mit der Beschichtung beginnen.

Jetzt werden wir das Polystyrol in unserer Einrichtung spinbeschichten. Unser Spin-Beschichter befindet sich in einer Reinraumumgebung. Daher müssen wir hier eine Haube, Schutzbrille, einen Kittel, Schuhüberzieher und Handschuhe tragen, doch dies könnte in Ihrer Einrichtung anders sein.

Bevor wir diesen Spannfutter verwenden, möchte ich ihn vor dem Polystyrol schützen. Daher werden wir ihn mit Aluminiumfolie bedecken und diese so glatt wie möglich an der Oberfläche anbringen, damit der Chip bündig auf der Oberfläche aufliegen kann. In der Mitte werden wir ein kleines Loch einstechen, damit wir ein Vakuum an dem Chip aufrechterhalten können.

Der Spin-Code wird auf 2.400 U/min und 30 Sekunden eingestellt. Nun nehmen wir einen unserer Chips, platzieren ihn so, dass die Mitte des Chips das Loch bedeckt, und ich werde zunächst das Vakuum ausschalten, wenn ich das Polystyrol auflege, dann das Vakuum einschalten und anschließend den Spin-Vorgang starten. Für die kleineren Teile können wir etwas weniger als 10 Tropfen auftragen.

Und für die größeren Teile benötigt man etwas mehr als 10 Tropfen Polystyrol. Wir werden sie 30 Sekunden lang bei 2.400 U/min schleudern. Nun nehmen wir die mit Polystyrol beschichteten Chips und legen sie in den Ofen bei 120 °C. Das liegt über dem Glasübergangspunkt des Polystyrols.

Es wird also die Oberfläche neu verflüssigen, um sie etwas zu glätten, und zudem den Kunststoff verdichten und verhärten. Daher lasse ich es normalerweise über Nacht im Ofen. Für den Abschluss des Prozesses benötigt es vermutlich mindestens einige Stunden.

Nach dem Backen über Nacht sind die Chips bereit für die Plasmabehandlung. Nun werden wir das Polystyrol einem Sauerstoffplasma aussetzen, wodurch sich die Oberflächenenergie verändert, sodass Proteine und Zellen besser daran haften können. Wir laden die Chips also einfach in die Plasmaanlage und pumpen sie auf Vakuum ab.

Eine geeignete Einstellung ist 200 mil Vakuum und 200 Watt Leistung für eine Minute unter Sauerstoffgasstrom. Da das System nun evakuiert ist, werden wir Sauerstoff zuführen. Gut, jetzt können wir die HF-Leistung einschalten und das Plasma für eine Minute zünden.

Wenn das Plasma läuft, leuchtet es tatsächlich. Es ähnelt einer Leuchtstofflampe. Nach einer Minute Plasmaexposition erhöhen wir den Druck wieder auf atmosphärisches Niveau, und wir können die Teile herausnehmen.

Nun sind die Teile bereit für die Proteinbeschichtung und die Zellversorgung. Das Ziel bei der Konstruktion dieses Geräts bestand darin, die mikroarchitektonische Struktur von Gewebe dynamisch manipulieren zu können. Die mikroskopische Organisation von Gewebe im Körper, insbesondere die räumliche Anordnung der Zellen zueinander, ist nämlich entscheidend dafür, welche Funktion eine bestimmte Zelle in der Laborzellkultur ausübt.

Bis vor Kurzem konnten wir dies nicht gut nachbilden, aber in den letzten fünf bis zehn Jahren ist es möglich geworden, Zellen mikrostrukturiert auf ein Zellkultursubstrat zu platzieren und sie damit genau dort hinzubringen, wo wir sie in einer Zellkulturplatte haben möchten. Dadurch konnten wichtige Aspekte der grundlegenden Biologie von Zell-Zell-Interaktionen im Mikromaßstab entdeckt werden. Was wir bis zu diesem Zeitpunkt jedoch nicht geschafft haben, ist, dies dynamisch durchzuführen.

Das bedeutet, die Organisation einer Zellkultur in der Mitte Ihres Experiments zu verändern. Das ist wichtig, weil das Gewebe im Körper keine statische Umgebung ist. Wir haben Zellen, die sich bewegen und neu organisieren, insbesondere bei der Wundheilung oder Entwicklung.

Doch selbst in einem normalen Organ im Zustand der Homöostase bewegt sich eine Menge. Der schwierigste technische Aspekt, den man lernen muss, ist die physische Handhabung der Teile. Zu Beginn, wenn man erstmals mit dem System arbeitet, kann es einschüchternd wirken, wie empfindlich die Teile sind oder wie fein die Bewegungen sein müssen.

Aber ich denke, dass Sie keine allzu großen Schwierigkeiten haben sollten, wenn Sie etwas Zeit mit der Übung verbringen. Einige der Bereiche, in denen wir sehen, dass dieses Gerät eine Rolle spielt, sind beispielsweise die embryonale Entwicklung, bei der Zellen während des Durchbruchs durch verschiedene embryonale Schichten mit einer Abfolge unterschiedlicher Zellumgebungen in Kontakt kommen. Es ist bekannt, dass die Wechselwirkungen mit jeweils einer Schicht, wenn nacheinander Kontakt hergestellt wird, die Zellen immer weiter entlang eines bestimmten Differenzierungswegs voranbringen.

Daher sind wir der Ansicht, dass diese Art von Vorrichtung gut geeignet sein könnte, um solche Ereignisse im Labor nachzubilden. Ein Aspekt der mikrobiellen Organisation, den wir besonders untersuchen wollten, war der Unterschied zwischen Zellen, die über Kontaktwechselwirkungen kommunizieren, bei denen die Zellmembranen direkt aneinanderstoßen können, und löslichen Faktoren, die in das umgebende Medium abgegeben werden und zu einer etwas weiter entfernt liegenden Zelle diffundieren. Häufig ist es, wenn Zellen in einer Co-Kultur stehen und sich gegenseitig beeinflussen, unklar, ob diese Wechselwirkungen auf direktem Kontakt oder auf sezernierten Faktoren beruhen, die die entscheidende Rolle spielen.