Eine β-Glucuronidase (GUS) Basierend Cell Death Assay

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe eines Gus-Reportersystems die potenziellen toxischen Eigenschaften spezifischer Gene zu analysieren. Die Gene von Interesse werden in eine Gus-Kassette kloniert und in den entsprechenden Agrobakterium-Vektoren unter einem 35S-Promotor vermehrt. Diese Vektoren werden anschließend in den Agrobacterium-Stamm LBA 4404 transformiert und mit einer Kultur, die eine Gus-Expressionskassette enthält, gemischt, um Nicotiana occidentalis-Hamana-Blätter zu infiltrieren.

Die Gus-Aktivität kann visuell durch histochemische Färbung oder quantitativ durch fluorimetrische Mug-Assays bestimmt werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie DNA-Laddering oder TUNEL-Assay, die üblicherweise in Säugetiersystemen eingesetzt werden, sich aber schwer in Pflanzen reproduzieren lassen, liegt darin, dass es sich um einen empfindlichen, schnellen, pflanzenbasierten transienten Test handelt, der die einfache Tatsache nutzt, dass lebende Zellen für die GUS-Expression erforderlich sind. Die Demonstration des Verfahrens übernimmt heute Hua RAOs.

Eine Post-Doc-Forschungskraft in unserem Labor: Die Infiltration erfordert vollständig entwickelte, gesunde Blätter von drei bis sechs Wochen alten Nicotiana benthamiana-Pflanzen, die bei 25 Grad Celsius gezüchtet wurden. Planen Sie, dieses Protokoll über acht Tage durchzuführen. Tag eins: Streichen Sie Agarplatten mit Glycerin-Stämmen von Agrobacterium tumefaciens, die die Vektoren für den Zelltod-Assay und den Vektor mit der Gus-Expressionskassette enthalten. Führen Sie stets auch einen leeren Vektor als negativen Kontroll- oder Platzhaltervektor ein, wenn mehrere Kulturkombinationen getestet werden.

Inkubieren Sie die Platten zwei Tage lang bei 28 Grad Celsius. Am dritten Tag impfen Sie zwei Milliliter selektives LB-Medium mit einer einzelnen Kolonie von jeder Platte an. Inkubieren Sie jede Kultur unter Schütteln bei 28 Grad Celsius für 24 Stunden bei 200 U/min, bis die maximale Wachstumsdichte erreicht ist.

Nach 24-stündiger Inkubation die Kultur vollständig durch Pipettieren resuspendieren, falls Verklumpungen auftreten, und das Gesamtvolumen jeder Kultur durch Zugabe frischen selektiven LB auf 10 Milliliter erhöhen, um die Virulenzgene von Agrobacterium zu induzieren. Aceton auf eine Konzentration von 25 Mikromolar zugeben und jede Kultur weitere 16 Stunden bei 28 Grad Celsius unter Schütteln inkubieren. Im nächsten Schritt jede Kultur bei Raumtemperatur 10 Minuten lang mit 4.000 G zentrifugieren und das Pellet in 10 Milliliter Infiltrationsmedium resuspendieren.

Fügen Sie kein Aceton hinzu, zentrifugieren Sie die Kulturen erneut, sondern resuspendieren Sie jedes Pellet in fünf Millilitern Infiltrationsmedium, das 100 Mikromolar Aceton enthält. Messen Sie nun die Extinktion bei 600 Nanometern.

Konzentrationen von nur 0,1 sind akzeptabel, aber wenn sie höher als 0,9 sind, dann vor der Infiltration mit Infiltrationsmedium und Aceton auf 0,9 verdünnen. Inkubieren Sie die Kulturen nach der Inkubation erneut bei 28 Grad Celsius unter Schütteln für drei Stunden. Mischen Sie die experimentellen Kulturen und die Kontrollkulturen im Verhältnis eins zu eins mit der Kultur, die die Gus-Kassette enthält.

Verwenden Sie für jede Kultur eine einmilliliterige nadelfreie Spritze, um die ABA-Dichtung oder die Unterseite neu entstehender Blätter zu infiltrieren. Das Infiltrationsvolumen ist nicht wichtig. Sobald sich ein Bereich mit Wasseransammlung gebildet hat, wurde genügend Flüssigkeit zugegeben; infiltrieren Sie dann die negative Kontrolle und das zu untersuchende Gen auf gegenüberliegenden Blättern derselben Pflanze und infiltrieren Sie anschließend auf gleiche Weise zwei weitere Pflanzen.

Es gibt also drei Pflanzen pro Kultur. Drei Tage nach der Infiltration ist es Zeit, die Blätter zu sammeln und die Expression des GUS-Proteins zu analysieren. Beginnen Sie die histochemische Analyse, indem Sie das gesamte Blatt unter Vakuum mit X-Gluc-Substrat infiltrieren, bis es vollständig durchtränkt ist.

Im Anschluss die Blätter über Nacht oder bis sich deutliche blaue Färbung zeigt bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren, wenn die blaue Färbung sichtbar ist. Die Blätter mit destilliertem Wasser abspülen und sie über Nacht in 70 % Ethanol inkubieren, bis das Chlorophyll entfernt ist. Am nächsten Tag die Blätter mit destilliertem Wasser abspülen und die GUS-Expressionslevel bestimmen.

Um die Gus-Expression zu quantifizieren, wird ein Substrat mug in ein fluoreszierendes Produkt mu umgewandelt, das gemessen werden kann, indem infiltrierte Blattscheiben in einem Mörser mit flüssigem Stickstoff zerkleinert werden. Anschließend 100 Mikroliter GUS-Extraktionspuffer hinzufügen, wobei die Probe auf Eis gehalten wird. Danach die Suspension fünf Minuten lang bei 14.000 ×g und vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand sammeln, der die löslichen Gesamtproteine einschließlich Gus enthält.

Messen Sie die Gesamtkonzentration an löslichem Protein mithilfe eines NanoDrop und stellen Sie die Konzentration auf 100 Mikrogramm Gesamtprotein pro Probe in Gus-Extraktionspuffer ein. Geben Sie nun Mug-Substrat in Gus-Extraktionspuffer zu jeder Probe hinzu, um eine Endkonzentration von zwei Millimolar Mug zu erreichen. Ein Gesamtvolumen von 100 Mikroliter pro Probe sollte ausreichen, gut durch Pipettieren vermischt werden und die Reaktion eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubiert werden.

Nach einer Stunde die Reaktion hinzufügen von 800 Mikrolitern GUS-Stop-Puffer beenden. Zur Quantifizierung werden 100 Mikroliter jeder Probe auf eine Mikrotiterplatte aufgetragen, die in einem Plattenreader analysiert wird. Dabei wird die Fluoreszenz bei 365 Nanometern Anregung und 455 Nanometern Emission gemessen und mit einer Standardkurve verglichen. Die GUS-Aktivität kann dann als M von µ pro Mikrogramm gesamten löslichen Proteins pro Minute Reaktionszeit angegeben werden. Abhängig vom verwendeten Konstrukt werden unterschiedliche GUS-Spiegel nachgewiesen, wenn die GUS-Expressionskassette gemeinsam mit einem negativen Regulator des Zelltods oder einem Anti-Tod-Gen ko-infiltriert wird.

Im Vergleich werden hohe Gus-Spiegel beobachtet. Die Gus-Spiegel in der Kontrolle mit leerem Vektor sind deutlich niedriger. Umgekehrt ergibt sich bei Verwendung eines positiven Regulators des Zelltods oder eines pro-apoptotischen Gens eine deutliche Verringerung der Gus-Expression im Vergleich zur Kontrolle mit leerem Vektor.

Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie in etwa einer Woche durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass diese Technik als erster Schritt zur Bestimmung des Potenzials spezifischer Gene dient. Weitere Arbeiten sind erforderlich, um diese vorläufigen Ergebnisse zu bestätigen und den Zelltyp zu identifizieren, der beteiligt ist.