Live-Bildgebung von Zell Extrusion aus der Epidermis der Entwicklung von Zebrafisch

Die Erhaltung epithelialer Gewebe erfordert die kontinuierliche Entfernung von geschädigten und absterbenden Zellen, ohne die Barrierefunktion zu beeinträchtigen. Um dies zu erreichen, extrudieren Epithelzellen sterbende Zellen, indem sie einen Ring aus Aktin und Myosin in der Zelle, die die absterbende Zelle umgibt, bilden und zusammenziehen, um diese auszustoßen und gleichzeitig eventuelle Lücken, die durch ihren Austritt entstanden sein könnten, zu schließen. In diesem Video-Artikel wird eine Methode beschrieben, um die Apoptose-induzierte Extrusion von Zellen aus dem Epidermis des Zebrafischlarven in Echtzeit zu induzieren und abzubilden.

Gezeigt wird dies durch die Injektion einer mit rotem fluoreszierendem Protein markierten F-Aktin-Sonde in Einzelzellstadium-Transgenen Zebrafischembryonen, die grünes fluoreszierendes Protein in der Epidermis exprimieren, um Aktinfilamente in epithelialen Geweben sichtbar zu machen. Vier Tage nach der Individualisierung werden Larven, die sowohl GFP als auch RFP exprimieren, anschließend mit G418 behandelt, um Apoptose in der Epidermis zu induzieren. Aktindynamik und Formveränderungen epithelialer Zellen während der Extrusion werden mittels Zeitrafferaufnahmen an einem Spinning-Disk-Konfokalmikroskop sichtbar gemacht.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Immunkraft- und Analyseverfahren besteht darin, dass wir schnelle Veränderungen und Aktin-Dynamiken beobachten können, die während des Extrusionsprozesses in lebendem epidermalem Gewebe auftreten. In diesem Video zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur Abbildung der Extrusion apoptotischer Zellen aus der Epidermis sich entwickelnder Zebrafische in Echtzeit. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um zu verstehen, wie Zellen koordiniert ihren Aktin-Zytoskelett umgestalten, um apoptotische Zellen zu entfernen, während sie gleichzeitig die Barrierefunktion aufrechterhalten, und wie Störungen im Extrusionsprozess zu bestimmten Krankheitszuständen führen können.

Beginnen wir damit, die Aktin-Dynamik während der Zellextrusion in der Epidermis sich entwickelnder Zebrafische sichtbar zu machen. Hierzu wird zunächst zuvor transkribierte RNA auf Eis aufgetaut. Wir transkribieren Mr.mRNA, die für ein rotes fluoreszierendes Protein kodiert, das mit der Calponin-Homologie-Domäne von Utrophin und dem Aktin-bindenden Protein fusioniert ist. Fügen Sie Phenolrot im Verhältnis 1:1 zur RNA hinzu, um eine endgültige RNA-Konzentration von etwa 30 Nanogramm pro Mikroliter zu erreichen, und füllen Sie ein Mikroliter der Lösung durch Rückbefüllung in eine gezogene Kapillarnadel.

Sammeln Sie etwa 75 Ein-Zell-Stadium-C-K-G-F-P-Embryonen in E-drei-Puffer. Pipettieren Sie die gesammelten Embryonen mit einer fünf-dreiviertel-Pasta-Pipette in die Mikroinjektionsform und richten Sie die Embryonen vorsichtig mit FST Dumont Nr. 5 Pinzette in der Rille aus. Arbeiten Sie schnell, um zu vermeiden, dass die RNA unter einem standardmäßigen laborüblichen stereoskopischen Mikroskop in Mehrzellstadium-Embryonen injiziert werden muss.

Verwenden Sie einen druckgesteuerten Mikroinjektor, um die RNA in das Eigelb der Embryonen als Phänol-Fossil zu injizieren. Nach der Injektion sollte Rot im Embryo sichtbar sein. Stellen Sie sicher, dass für jedes Experiment mindestens 50 Embryonen injiziert werden.

Sortieren Sie die Embryonen, um unbefruchtete oder beschädigte Eier zu entfernen, und inkubieren Sie alle verbleibenden Embryonen bei 28 Grad Celsius. Verwenden Sie nach 24 Stunden ein fluoreszierendes Stereomikroskop, um Zebrafisch-Embryonen auszuwählen, die eine hohe GFP-Fluoreszenz in der Epidermis und RFP-markierte Aktin-Fluoreszenz aufweisen. Inkubieren Sie die ausgewählten Embryonen bei 28 Grad Celsius, bis sie für die anschließende Behandlung mit dem Medikament zur Induktion der Apoptose durch Exposition gegenüber dem Aminoglykosid bereit sind.

Antibiotikum G vier 18 oder Medikament verursacht die Extrusion apoptotischer Zellen aus der Epidermis sich entwickelnder Zebrafischlarven. Wichtig ist, dass diese Behandlung nur bei Larven ab vier Tagen nach der Befruchtung zur Induktion der Zellextrusion wirkt. Sammeln Sie bis zu 25 Zebrafischlarven vier Tage nach der Befruchtung, die sowohl GFP als auch RFP exprimieren, in einer 35 mal 10 Millimeter großen Kulturschale mit drei Milliliter E-drei-Medium.

Ersetzen Sie das Medium vorsichtig durch drei Milliliter E drei, die ein Milligramm pro Milliliter G vier 18 enthalten, und inkubieren Sie die Larven vier Stunden lang bei 28 Grad Celsius im Dunkeln in der Droge. Entfernen Sie anschließend das Medium und ersetzen Sie es durch vorgewärmtes E-drei-Medium mit 0,02 % Trica, und fahren Sie mit der Montage der Larven zur Bildgebung fort. Überführen Sie bis zu drei Larven in ein 1,5-Milliliter-Fendor-Gefäß und entfernen Sie den größten Teil des E-drei-Mediums.

Unter Verwendung einer abgeschnittenen Pipettenspitze pipettieren Sie 120 Mikroliter 1 % Low-Melt-Agarose in das Röhrchen und mischen Sie vorsichtig. Anschließend pipettieren Sie die Larven und die Agarose-Mischung vorsichtig auf das Deckglas am Boden einer Matech-Kulturschale. Richten Sie mithilfe eines FST-Pin-Halters mit eingesetzter Nadel oder einer Wolframnadel die Larven schnell aus, sodass sie gerade und flach auf dem Deckglas aufliegen.

Lassen Sie das Aose verfestigen. Füllen Sie die Schale dann vorsichtig mit E3-Medium, das 0,02 % Trica enthält. Wir haben festgestellt, dass der gesamte Prozess der apoptotischen Zellausscheidung aus der Epidermis der sich entwickelnden Zebrafischlarven etwa 20 Minuten dauert.

Hier zeigen wir, wie man ein Zeitrafferaufnahmeverfahren mit einem Spinning-Disk-Konfokalmikroskop und der Andor IQ-Software einrichtet, um eine Serie von Z-Ebenen durch eine einzelne Schicht des Zebrafisch-Epidermis zu erfassen. Schalten Sie zunächst den Argon- und Helium-Neon-Laser, die Mikroskopkamera und die epifluoreszierende Lampe innerhalb der Andor IQ-Software ein. Erstellen Sie ein Zeitserien-Protokoll, das die abzubildenden Wellenlängen enthält.

Die Häufigkeit der Intervalle zwischen den Bildaufnahmen und die Anzahl der Wiederholungen der Aufnahme. Platzieren Sie die Petrischale mit der Probe vorsichtig auf dem Mikroskoptisch und verwenden Sie dann ein 20-fach-Objektiv mit Durchlicht, um auf die Larven zu fokussieren. Bringen Sie das 40-fach-Wasserimmersionsobjektiv in die korrekte Position. Mit diesem Objektiv können wir etwa 20 bis 25 Zellen pro Feld aufnehmen, was es uns ermöglicht, zelluläre Verhaltensweisen während der Extrusion zu verfolgen und gleichzeitig subzelluläre Aktin-Dynamiken aufzulösen.

Platzieren Sie vorsichtig einen Tropfen Wasser auf der Oberseite des 40-fach-Objektivs und setzen Sie die Mattec-Schale schnell darauf. Identifizieren Sie das Präparat mithilfe der Hellfeldbeleuchtung und verwenden Sie anschließend die 488-Nanometer-Epifluoreszenz, um gezielt auf das GFP-positive Epidermisgewebe zu fokussieren. Wechseln Sie in den konfokalen Abtastmodus.

Passen Sie die Laserintensität und Belichtungszeit entsprechend für jeden der Kanäle an. Achten Sie darauf, die Laserleistung und Belichtungszeit so auszugleichen, dass eine optimale Detektion Ihres Signals gewährleistet ist und keine Phototoxizität auftritt. Um ausschießende Zellen zu identifizieren, verwenden Sie die Epifluoreszenz, um das mit GFP markierte Epidermis sichtbar zu machen, und erkennen Sie eine Gruppe von Zellen in einem klassischen Rosettenmuster, das aus einer Ansammlung von Zellen besteht, die eine kleine runde Zelle in der Mitte umgeben.

Zusätzlich sollte eine Anhäufung des mit RFP markierten Aktins sichtbar sein, das als Ring um die kleine, runde Zelle in der Mitte angeordnet ist – ein charakteristisches Merkmal der Zellextrusion. Sobald eine extrudierende Zelle identifiziert wurde, legen Sie schnell die oberen und unteren Grenzen für die Z-Serie sowie die Schrittweite fest. Beginnen Sie dann mit der Aufnahme von vier 4D-konfokalen Datensätzen, um die Daten zu betrachten und die Kontraktion des Aktinrings sowie die epithelialen Verhaltensweisen um die sterbende Zelle herum zu visualisieren.

Erstellen Sie im Laufe der Zeit 3D-Projektionen der Z-Serie und speichern Sie die Daten als Videodatei. Dieser Schritt kann mit einer Vielzahl von Softwarepaketen durchgeführt werden. Diese Abbildung zeigt die Expression von RFP UTR CH im Epidermis eines vier Tage nach der Befruchtung alten CK GFP-Zebrafischlarven.

Hier sind Einzelbild-Z-Projektionen aus einem Zeitraffervideo, die die Dynamik von lebenden Aktinfilamenten verfolgen. Während des Prozesses der epithelialen Zell-Extrusion zeigen die Pfeile den von benachbarten Zellen gebildeten Aktinring, der sich innerhalb von zwei Minuten zusammenzieht und schließt. Nach diesem Verfahren können wir andere Methoden in Kombination mit dieser Technik anwenden, beispielsweise die Verwendung chemischer Inhibitoren oder genetischer Mutationen, um besser zu verstehen, wie eine veränderte Extrusion zu bestimmten Krankheitszuständen führen kann.

Ausgehend vom Versagen beim Abbau apoptotischer Zellen haben wir Ihnen soeben gezeigt, wie man ein Zeitrafferaufnahmeverfahren einrichtet, um den Ausschleusungsprozess aus dem Epidermis des sich entwickelnden Zebrafisches zu visualisieren. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Lichtmenge, der Ihre Probe ausgesetzt wird, zu begrenzen, um eine eventuelle Photobleiche oder Toxizität zu vermeiden. Damit ist alles gesagt.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.