Charakterisierung der isolierten, ventilierten und Instrumented Maus Lung mit pulsatilen Fluss perfundierten

Um pulsatile Druck-Fluss-Beziehungen in der Lunge zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt, wie Mauslungen isoliert, beatmet und perfundiert werden. Die Luftröhre wird chirurgisch freigelegt, um eine Beatmung durchzuführen.

Dann werden Herz und Lunge isoliert, sodass die Lungenarterie und das linke Vorhof kaniert werden können. Anschließend wird das Lungenkreislaufsystem perfundiert. Experimente werden durch Änderung des Flusses, der Größe, der Wellenform und/oder der Frequenz der Lungenarterie durchgeführt.

Die resultierenden Druckkurven der Lungenarterie und des linken Vorhofs werden aufgezeichnet und zeigen die pulsatile Beziehung zwischen Druck und Fluss im Lungenkreislauf. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie beispielsweise in-vivo-Präparationen, liegt darin, dass Veränderungen in der Druck-Fluss-Beziehung erfasst werden können. Pulsatile Druck-Fluss-Beziehungen können unabhängig von Änderungen des Volumenstatus, des Tons des sympathischen Nervensystems, der Aktivität und der Effekte von Anästhesie ermittelt werden.

Außerdem messen die meisten isolierten Lungenpräparationen lediglich stationäre Druck-Fluss-Beziehungen, während unsere Technik die Bestimmung pulsierender Druck-Fluss-Beziehungen ermöglicht. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der pulmonalen Physiologie zu beantworten, beispielsweise wie sich eine pulmonale Gefäßerkrankung auf die pulsatile pulmonale Hämodynamik auswirkt oder wie eine Versteifung großer pulmonaler Arterien die Nachlast des rechten Ventrikels beeinflusst. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Exposition von Herz und Lunge sowie die sichere Platzierung der Kanüle in der Arteria pulmonalis schwer zu erlernen ist.

Übermäßiger Druck durch Instrumente kann ein Lungenödem verursachen, und eine fehlerhafte Kanülenplatzierung kann die Lungenarterie perforieren. Vor Beginn des Experiments ist es notwendig, das IL-one-System vorzubereiten, das zur Beatmung und Perfusion der isolierten Lunge verwendet wird. Die Schläuche sollten mit den Druckmessfühlern verbunden werden.

O solitäre Pumpe und Durchflussmesser vollständig mit auf 37 Grad Celsius erwärmtem destilliertem Wasser spülen und alle Blasen in der Schlauchleitung entfernen. Danach die Endur-Tech-Pumpenschläuche mit 1 % PBS vorbelegen. Jetzt nullen.

Der Druck jedes P 75-Transducers wird eingestellt, indem zunächst sein Ventil zum IL-System geschlossen und dann sein Ventil zur Atmosphäre geöffnet wird. Anschließend verwenden Sie den Plug-SIS-Verstärker, um den Druck automatisch auf Null zu stellen, bevor Sie das Tier vorbereiten. Befeuchten Sie die IO-Einrichtung, indem Sie das keramische poröse Teil in destilliertem Wasser einweichen. Nach der Anästhesie des Mäuschens stabilisieren Sie es für die Operation, indem Sie die Vorderpfoten auf einer Korkplatte fixieren.

Sprühen Sie nun die Brust mit 95 % Alkohol ein. Greifen Sie mit einer geraden Pinzette die Haut am Hals und schneiden Sie mit der geraden Schere einen einen Zentimeter langen Einschnitt. Sobald das Innere des Halses freigelegt ist, entfernen Sie das weiße drüsige Gewebe aus den oberflächlichen Muskeln, während Sie nach der Speiseröhre und der Luftröhre suchen.

Isolieren Sie die Speiseröhre und die Luftröhre von dem umgebenden Gewebe an beiden Seiten und posterior und legen Sie eine lose Naht um die Luftröhre. Um die Luftröhre zu kanülieren, schneiden Sie vorsichtig mit der kleinen Schere ein kleines V in eine Seite der Luftröhre. Bringen Sie nun die Maus mit stumpfen Pinzetten zum IL-one-System.

Nehmen Sie die Trachealkanüle und schieben Sie sie in die Luftröhre. Sichern Sie die Kanüle mit einer Naht. Beginnen Sie die Beatmung zunächst mit Raumluft, besprühen Sie die Brust mit Alkohol und entfernen Sie die Haut mit geraden Pinzetten und geraden Scheren.

Schneiden Sie die Haut entlang des Brustbeins nach oben auf. Heben Sie die Haut beidseits an und schneiden Sie entlang der Linie der unteren Rippen. Greifen Sie nun den Xiphoidfortsatz mit einer Pinzette und verwenden Sie eine Rundspitzen-Schere, um ein Loch in das Zwerchfell zu schneiden, dort, wo es an der unteren Brustbeinpartie ansetzt.

Greifen Sie das Zwerchfell und schneiden Sie es von den Rippen ab. Greifen Sie mit kugelspitigen Scheren erneut den Xiphoidfortsatz und schneiden Sie vorsichtig mit den kugelspitigen Scheren entlang des Brustbeins durch die Rippen, ohne die Lunge, das Herz oder die Blutgefäße zu beschädigen. Um das Herz freizulegen, greifen Sie die linken Rippen und schneiden deren Spitzen ab.

Injizieren Sie nun langsam 0,1 Milliliter Heparin in den rechten Ventrikel. Nach der Injektion entfernen Sie den restlichen Rippenbogen. Benutzen Sie die Rückseite oder das abgerundete Ende der Pinzette, um die Lunge vorsichtig von der Rippe wegzuschieben, während Sie die Rippen unter dem Mikroskop durchtrennen. Entfernen Sie das drüsenförmige Gewebe im Fettgewebe oberhalb des Herzens.

Verwenden Sie die Pinzette, um das Gewebe wegzuziehen und abzuschneiden. Platzieren Sie mit der Feder-Schere einen Faden um Aorta und Lungenarterie und heben Sie das Herz vorsichtig mit einer stumpfen Pinzette an. Es sollte kaum Widerstand bestehen.

Jetzt einen lockeren Nahtfaden mit Doppelschlinge anlegen. Anschließend den unteren Bauchbereich entfernen. Mit gekrümmten Scheren durch die Rippen und die Wirbelsäule schneiden.

Dadurch kommt es zu einem erheblichen Blutfluss. Verwenden Sie einen Wattestäbchen, um die Blutung zu stillen. Sobald der Blutfluss gestoppt ist, spülen Sie das IL-System mit vier Millilitern RPMI aus einer Spritze, die mit 10 Millilitern RPMI gefüllt ist.

Es ist ratsam, nochmals zu überprüfen, ob sich in der Schlauchleitung keine Blasen befinden. Kanülieren Sie nun den rechten Ventrikel, indem Sie nahe der Spitze einen kleinen Einschnitt machen und die Kanüle einführen. Zielen Sie nach unten in Richtung rechts, um die Lungenarterie zu erreichen. Die Spitze der Sonde sollte durch die nahezu durchsichtige Wand der Lungenarterie sichtbar sein.

Danach die Naht um die Kanüle, die Aorta und die Lungenarterie festziehen, um den linken Ventrikel zu kanülieren. Eine Kerbe in der Herzspitze schneiden und die Kanüle mit leichter Aufwärtsneigung in den linken Vorhof einführen. Es kann leichter Druck erforderlich sein, um die Herzklappe zu finden; sobald sie lokalisiert ist, gleitet die Kanüle hindurch und sitzt sicher, ohne dass eine Naht notwendig ist.

Infundieren Sie RPMI manuell aus der 10-Milliliter-Spritze mit 0,3 Millilitern pro Minute, bis ein Durchfluss in der Ausflussleitung sichtbar ist. Falls kein Durchfluss in der Ausflussleitung vorhanden ist, positionieren Sie die Linksherzkammer-Kanüle neu. Falls jedoch kein Durchfluss in den Lungen vorhanden ist, brechen Sie den Versuch ab, da wahrscheinlich eine Leckage in der Lungenarterie vorliegt.

Nachdem das Herz nun vollständig kanüliert ist, verbinden Sie die 60-Milliliter-Spritze mit dem IL-one-System. Verwenden Sie die Konstantstrompumpe, um das RPMI Perfuse eight mit einer Rate von einem Milliliter pro Minute zuzuführen. Prüfen Sie während der anfänglichen Perfusion auf Leckagen.

Perfundieren Sie die Lungen allmählich weitere zwei Minuten lang, wobei die Lungen weiß werden. Für pulsatile Flussstudien. Stellen Sie zuerst die Kolbenhubweite der einzelnen Pumpe auf die gewünschten Werte ein.

Danach die konstante Durchflussrate einstellen. Nun das Ventil zur OSLI-Pumpe öffnen und die Datenaufzeichnung unmittelbar vor dem Starten des OSLI-Durchflussprofils beginnen. Sobald Sie fertig sind, die Datenausgabedatei öffnen und den experimentellen Durchfluss anhand der Durchflusswerte aus dem ersten Versuch darstellen.

Stellen Sie die Kolbenhublänge der oszillierenden Pumpe bei jeder Frequenz so ein, dass Q max den gewünschten Wert erreicht. Halten Sie die Beatmung während der Datenaufnahme für stationäre Durchflussversuche auf konstantem Druck und schließen Sie das Ventil zur einzelnen Pumpe, während Sie den stationären Durchfluss auf den gewünschten Wert einstellen. Beginnen Sie mit der Datenaufnahme und führen Sie das Protokoll für den stationären Durchfluss schrittweise durch.

Sammeln Sie Daten für mindestens 10 Sekunden bei jeder Durchflussrate zwischen den Versuchen. Stellen Sie die Durchflussrate auf 0,5 Milliliter pro Minute zurück. Achten Sie darauf, die Beatmung während der Datensammlung auf einem konstanten Druck zu halten.

Wenn Versuche mit einem linken atrialen Druck von null gewünscht sind, entfernen Sie das Ausflussrohr während der Durchführung der Versuche. Achten Sie sorgfältig darauf, dass RPMI in das Atemwegsrohr gelangt. RPMI darf die Druckmesswandler der Atemwege nicht erreichen, da sie sonst beschädigt werden.

Hier sind die Ergebnisse der stationären Flussperfusion mit dem Fluss Q in der oberen Reihe und den resultierenden Drücken in der Lungenarterie und im linken Vorhof in der zweiten Reihe unter verschiedenen Bedingungen. In den ersten beiden Feldern stieg und fiel der Druck im linken Vorhof mit Q, da die Ausflussleitung vorhanden war; im ersten Feld ist der Luftdruck am Ende, inspiratorischer Druck, dargestellt, im zweiten Feld der Luftdruck am Ende des Exspiriums, expiratorischer Druck. Anschließend wurde die Leitung entfernt, sodass der Druck im linken Vorhof konstant und unabhängig von Q war. Danach wurde die Höhe der Auslassleitung manuell angepasst, sodass der Druck im linken Vorhof höher war.

Doch unabhängig von Q zeigt das erste Feld den Luftdruck am Ende, den inspiratorischen Druck, und das zweite Feld zeigt den Luftdruck am Ende. Exspiratorischer Druck. Die sich ergebenden stationären Beziehungen zwischen Pulmonalarteriendruck und -fluss für jeden Fall können durch Auftragen des Drucks über dem Fluss erhalten werden.

Hier sind die Ergebnisse der pulsierenden Strömungsperfusion mit dem Fluss Q im oberen Feld sowie den resultierenden Drücken in der Lungenarterie, dem linken Vorhof und im Luftdruck im unteren Feld. Aus diesen pulsierenden Beziehungen zwischen pulmonalem Druck und Fluss kann die pulmonale vaskuläre Impedanz berechnet werden, die die gesamte Nachlast des rechten Ventrikels widerspiegelt.

Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie in 20 bis 30 Minuten durchgeführt werden. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, sich Zeit zu nehmen und zu entspannen, damit die Hände ruhig bleiben. Sobald die Lungen ausreichend perfundiert sind, ist der schwierige Teil vorbei.

Nach diesem Verfahren können weitere Techniken wie Histologie oder biochemische Assays am Lungengewebe durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise welche molekularen Mechanismen für die beobachteten Veränderungen in den pulmonalen pulsierenden Druck-Fluss-Beziehungen verantwortlich sind. Diese Technik eröffnet Forschern auf dem Gebiet der pulmonalen Physiologie die Möglichkeit, die Rolle spezifischer Gene und Proteine bei der Entstehung und Progression von pulmonalen Gefäßerkrankungen unter Verwendung genetisch modifizierter Mäuse zu untersuchen.