Solide Plate-basierte diätetische Einschränkung in Caenorhabditis elegans

Das Verfahren führt eine Nahrungseinschränkung auf dem standardmäßigen Agarplatte in Sea Elegance durch, um deren Auswirkungen auf Langlebigkeit, Fortpflanzung und Stoffwechsel zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Konzentration der Bakterien, die als Nahrungsquelle verwendet werden, genau gemessen wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Bakterienkultur korrekt auf geeignete Konzentrationen zu verdünnen.

Dann bereiten Sie SDR-Platten mit abgetöteten Bakterien vor. Richten Sie abschließend SDR-Experimente mit einer alterssynchronisierten Population von Würmern ein. Die Ergebnisse von Nachkommenschaftsproduktion und Lebensdauermessungen können eine verzögerte und verminderte Nachkommenschaftsproduktion sowie eine verlängerte mittlere Lebensdauer zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber 60 Methoden wie Dian in AZA-Medium besteht darin, dass das gesamte Experiment auf einem standardmäßigen festen AGA-basierten Medium durchgeführt wird, das von den meisten Wärme-Laboren für Diätrestriktionsversuche verwendet wird. Erstellen Sie separate Kalibrierkurven für jeden Bakterienstamm, der als Nahrungsquelle eingesetzt wird. Entnehmen Sie eine einzelne Kolonie des Bakteriums E. coli OP50 von einer frischen Strichplatte auf LB-Agar und impfen Sie drei Milliliter flüssige LB-Brühe in einem 37-Grad-Celsius-Schüttler über Nacht an. Bereiten Sie serielle Verdünnungen im Verhältnis 1:2 der Übernachtkultur vor.

Danach die Extinktion jeder Verdünnung bei 600 Nanometern mittels Spektrophotometer im Dreifachansatz messen. Weitere Verdünnung jeder Bakteriensuspension um den Faktor 1 Million; jeweils 0,4 Milliliter der Bakteriensuspension jeder Verdünnung gleichmäßig auf einer 100 Millimeter LB-Agarplatte ausplattieren und 18 bis 24 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Die Anzahl der auf jeder Platte gewachsenen Bakterienkolonien zählen, um die Anzahl an koloniebildenden Einheiten pro Milliliter für jede Probe zu berechnen.

Tragen Sie nun den OD 600 als Funktion der bakteriellen Konzentration auf und führen Sie eine lineare Regressionsanalyse durch, um den Zusammenhang zwischen den gemessenen OD-600-Werten und den OP-50-Bakterienkonzentrationen zu ermitteln. Für diese Methode wird eine Bakterienkonzentration von 1 × 10¹¹ KBE pro Milliliter unter ad libitum-Fütterungsbedingungen und 1 × 10⁸ KBE pro Milliliter als optimale DR-Fütterungsbedingung verwendet. Es können jedoch vier bis sechs verschiedene Bakterienkonzentrationen erforderlich sein, um einen vollständigen dosisabhängigen Zusammenhang zu etablieren.

Für SDR und deren Reaktionen. Bereiten Sie ein Inokulum mit einer einzelnen Kolonie von E. coli OP50-Bakterien in drei Millilitern flüssigem LB-Brühe vor, das bei 37 Grad Celsius im Schüttelinkubator sechs bis acht Stunden lang kultiviert wird. Überführen Sie die OP50-Kultur in einen neuen Kolben, der 500 Milliliter LB-Brühe enthält, und züchten Sie sie über Nacht, falls erforderlich, bis die Bakterien die Sättigung erreicht haben.

Stellen Sie eine geeignete Verdünnung der OP 50-Kultur zur Messung der Absorption bei OD 600 her. Um die Bakterienkonzentration zu bestimmen, pelletieren Sie die Bakterien durch Zentrifugation bei 1500 Gs für 20 Minuten. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Bakterien in einer Konzentration von einem Mal 10 hoch 12 KBE pro Milliliter.

Bereiten Sie nun 10 Milliliter Bakterienkulturen in sechs verschiedenen Konzentrationen vor, die von 1 × 10¹² bis 1 × 10⁷ KBE pro Milliliter reichen. Pipettieren Sie 0,2 Milliliter Bakterienkultur in die Mitte einer 60 Millimeter großen, festen N-GM-Platte. Vermeiden Sie es, mit der Pipettenspitze die Oberfläche der Platte zu berühren, da Kratzer auf der Oberfläche es Würmern ermöglichen, in die Belüftungsschicht einzudringen.

Stellen Sie die Platten eine Stunde lang in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator. Geben Sie anschließend auf jede Platte jeweils 10 Mikroliter einer 100 Milligramm pro Milliliter Carbonic-Sojin-Lösung und 10 Mikroliter einer 50 Milligramm pro Milliliter Canmycin-Lösung, um das Bakterienwachstum zu hemmen. Lagern Sie die Platten mit unterschiedlichen Konzentrationen an antibiotikabehandelten Bakterien bei vier Grad Celsius für zukünftige Verwendung bis zu einem Monat.

Es ist wichtig, ausreichend Platten vorzubereiten und aufzubewahren, vorzugsweise aus derselben Charge für die gesamte Pflanze. Führen Sie das Experiment mindestens ein bis zwei Tage im Voraus durch, um die Lebensfähigkeit der Bakterien zu überprüfen. Entnehmen Sie etwas Bakterienmaterial von den SDR-Platten und streichen Sie es auf eine leere N-GM-Platte mit Kohlensäure, Sein und Antimycin.

Stellen Sie die Platte sechs bis acht Stunden lang in einen 37 Grad Celsius warmen Inkubator und überprüfen Sie das Fehlen von bakteriellem Wachstum. Für die meisten SDR-bezogenen Studien, wie beispielsweise die Analyse der Lebensdauer und die Profilierung der Nachkommenproduktion, ist die Herstellung einer alterssynchronisierten Population von Würmern unerlässlich. Übertragen Sie mithilfe eines Platin-Wurm-Pickers 20 bis 30 reproduktiv aktive adulte Tiere auf mehrere gewöhnliche NGM-Platten.

Bei OP 50. Abhängig von der Anzahl der für die Experimente benötigten Eier können mehr erwachsene Tiere erforderlich sein. Belassen Sie die Platten vier Stunden lang bei 20 Grad Celsius, um die Eiablage zu ermöglichen.

Entfernen Sie die erwachsenen Tiere von der Platte und untersuchen Sie die Platten visuell auf Eier. Inkubieren Sie die Platten weiterhin bei 20 Grad Celsius, damit die Nachkommen sich bis zum späten L4-Stadium oder Ein-Tages-erwachsenen-Stadium entwickeln können. Normalerweise dauert dies drei Tage für N2-Wildtyp-Würmer bei 20 Grad Celsius.

Für die Lebensdaueranalyse. Überführen Sie 10 bis 12 ein Tage alte erwachsene Würmer auf eine SDR-Platte, um die diätetische Restriktion zu beginnen. Um eine ausreichende statistische Aussagekraft zu erzielen, verwenden Sie insgesamt 60 bis 100 Würmer pro SDR-Bedingung.

Bewerten Sie die Lebensfähigkeit jedes Wurms alle zwei bis drei Tage, bis alle Würmer verstorben sind. Wichtig: Überführen Sie die Würmer jeden zweiten Tag auf frische SDR-Platten, um Verhungern zu vermeiden. Diese Kalibrationskurve zeigt die OP50-Konzentration in Abhängigkeit von OD 600.

Die durch die lineare Regressionsanalyse erhaltene Gleichung kann für alle zukünftigen Berechnungen der OP 50-Bakterienkonzentrationen verwendet werden. Diese Studie untersucht den Effekt chronischer SDR-Behandlungen auf die mittlere Lebensdauer verschiedener Wurmsorten im Vergleich zu einer normalen dosisabhängigen Reaktion von Wildtyp-Würmern auf SDR. Der Einfluss von SDR auf die Lebensdauer wird durch die Überexpression von DR zwei teilweise unterdrückt, während die DAF 16 MU 86-Mutation keinen Einfluss auf die von SDR induzierte Lebensverlängerung hat.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Dian auf dem Standard-AGA-basierten Spiel in Sea Elegance durchführt.