Visualisierung der MG53-vermittelte Cell Membrane Repair mit In vivo Und In-vitro- Systems

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Membranreparaturkapazität sowohl im Tier als auch in isolierten Zellen zu bewerten. Isolierte Skelettmusikelfasern werden gesammelt und in ein Medium gegeben, das den Farbstoff FM 1 43 enthält. Anschließend wird mittels eines UV-Lasers ein Teil der Zellmembran bestrahlt und beschädigt, um den Eintritt des Farbstoffs in die Zelle zu ermöglichen.

Isolierte Zellen werden mit Plasmadna transfiziert, die GFP MG 53 exprimiert, welches sich an der Plasmamembran und im Cytosol der Zelle anreichert. Anschließend wird die Spitze einer Mikroelektrode in die C zwei C 12-Membran eingeführt, um eine Schädigung zu induzieren. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die die Translokation von GFP MG 53 an die Verletzungsstelle zeigen.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da bestimmte Praktiken erforderlich sind, um die Techniken der Mikroelektrodenpenetration und der Muskelzellisolation zu beherrschen. Die Durchführung des Verfahrens zeigen Dr. Lin, unsere Laborleiterin, Dr. Wazu, ein Postdoktorand, Matt Orange, ein Doktorand, sowie Dr. Shaza, eine wissenschaftliche Assistentenprofessorin an unserer Abteilung. Um zu beginnen, stellen Sie eine Schale oder ein blaues Labortuch unter das Laufband, um Abfälle der Tiere während des Experiments aufzufangen.

Als Nächstes wird der Neigungswinkel der Lauffläche eingestellt. Einige Laufbänder verfügen über eine integrierte Vorrichtung zur Neigungsverstellung, während andere durch zusätzliche Hilfsmittel angehoben werden müssen. Üblicherweise wird eine ebene Fläche oder ein Winkel zwischen sieben und 15 Grad bergauf oder bergab verwendet.

Gewöhnen Sie die Mäuse an das Laufband, indem Sie sie bei ausgeschalteter elektrischer Reizung und eingeschaltetem, aber stillstehendem Laufbandmotor für 15 Minuten darauf platzieren. Nach der Eingewöhnungsphase schalten Sie das motivierende elektrische Gitter ein. Starten Sie das Laufband mit einer Anfangsgeschwindigkeit von etwa fünf Metern pro Minute. Erhöhen Sie die Geschwindigkeit jede Minute um ein bis zwei Meter pro Minute und gewähren Sie dem Tier eine fünfminütige Aufwärmphase.

Wiederholen Sie diese Aufwärmphase jeden Tag für drei bis zehn Tage, um die Compliance während der Tests zu erhöhen. Um eine akute Erschöpfungsbelastung durchzuführen, erhöhen Sie im Laufe der Zeit die Geschwindigkeit des Laufbandes, bis eine maximale Geschwindigkeit erreicht ist, und beobachten Sie Anzeichen von Erschöpfung.

Ein Tier gilt als erschöpft, wenn es mehr als die Hälfte der Zeit außerhalb des Laufbandes verbringt oder fünf aufeinanderfolgende Sekunden auf dem Gitter steht. Entfernen Sie die erschöpfte Maus und notieren Sie die gesamte Laufzeit. Ausdauertraining.

Laufprotokolle beginnen mit dem gleichen Aufwärmverfahren. Die maximale Geschwindigkeit ist jedoch in der Regel niedriger, und die Laufzeiten können recht lang sein. Bringen Sie die Mäuse nach der Untersuchung in ihren Heimkäfig zurück und reinigen Sie das Laufband mit 70 % Ethanol.

Isolezieren Sie die oberflächliche Schicht des Musculus flexor digitorum brevis aus dem Fuß zur weiteren Analyse. Schneiden Sie zunächst die Haut der Fußsohle entlang der Mittellinie auf, wobei darauf geachtet werden muss, den darunterliegenden Muskel nicht zu beschädigen. Danach horizontale Schnitte durchführen und die Haut entfernen.

Identifizieren Sie die flache weiße Sehne des M. flexor digitorum brevis, die am Fersenbein (Calcaneus) ansetzt. Trennen Sie mit einer Pinzette die Sehne und durchtrennen Sie sie nahe der Ansatzstelle. Ziehen Sie die Sehne vorsichtig nach oben, während Sie das umgebende Bindegewebe abschneiden.

Suchen Sie die Stelle, an der die distalen Sehnen in die einzelnen Zehen abzweigen. Durchtrennen Sie die Sehnen dort, wo sie mit der tieferen Muskelschicht verbunden sind, und entfernen Sie den Musculus flexor digitorum brevis (FDB). Geben Sie das FDB-Muskelbündel in ein Milliliter Kollagenase-Lösung, die auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde.

Befestigen Sie das Röhrchen horizontal mit Klebeband an einem orbitalen Schüttler bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie es 65 Minuten lang bei 200 U/min. Ein ausreichender Verdau ist durch ein flockiges Aussehen und eine blasse Farbe gekennzeichnet. Schneiden Sie das Ende einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze ab, damit das verdaute Bündel hindurchpassen kann.

Überführen Sie das Bündel leicht in ein Zentrifugenröhrchen, das etwa 600 µL 2,5 %iger Calcium-Tyro enthält. Drehen Sie das Röhrchen vorsichtig um, um die losen Fasern aus dem Bündel zu lösen.

Schneiden Sie anschließend das Ende einer 30-Mikroliter-Pipettenspitze ab, sodass der Durchmesser nur geringfügig kleiner als der des Muskelbündels ist. Ziehen Sie mit dieser Spitze das Bündel in die Pipette hinein und schieben Sie es dann wieder zurück in die Lösung. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis der Großteil der Fasern vom Bündel gelöst ist.

Mischen Sie die dissoziierten Fasern, indem Sie das Reagenzglas vorsichtig umdrehen. Entnehmen Sie die gewünschte Menge und geben Sie sie auf eine Glasboden-Delta-T-Schale. Bewahren Sie die restlichen Fasern für etwa sechs Stunden bei vier Grad Celsius zur weiteren Verwendung und für zusätzliche Untersuchungen auf.

Lassen Sie die Schale fünf Minuten lang ungestört stehen. Dadurch können sich die Fasern an dem Glasboden der Schale festsetzen. Stellen Sie die Schale mit Glasboden auf ein konfokales Mikroskop, das mit einem UV-Laser ausgestattet ist.

Die Fasern unter der Phasenkontrastmikroskopie mit einer Vergrößerung von mehr als 100 x auf das Vorhandensein eines normalen Streifungsmusters und einer geraden, stabförmigen Gestalt überprüfen. FM 1 43 oder FM 4 64 Styro perineum Farbstoffe bis zu einer Endkonzentration von 2,5 µmol/l zur Lösung hinzufügen. Die Faser so ausrichten, dass sie im Sichtfeld von oben links nach unten rechts in einem Winkel von 45 Grad verläuft, um Schäden zu induzieren.

Bestrahlen Sie einen Bereich von fünf mal fünf Pixeln der Plasmamembran. Unter Verwendung eines UV-Lasers, der auf maximale Leistung eingestellt ist, für fünf Sekunden sollte der bestrahlte Bereich die Plasmamembran so teilen, dass die Hälfte des Fünf-mal-Fünf-Kästchens innerhalb der Faser liegt, während der Rest außerhalb der Faser liegt. Erfassen Sie Bilder zum Eindringen des Farbstoffs in die Faser in Abständen von jeweils fünf Sekunden über einen Zeitraum von bis zu fünf Minuten. Pro Schale dürfen nur drei Fasern bestrahlt werden, da der fluoreszierende Farbstoff letztendlich in die Faser endozytiert wird und dadurch die Datenanalyse erschweren würde.

Nach der Verwendung von drei Fasern sollte eine neue Petrischale vorbereitet werden. Mithilfe einer Analyse-Software berechnen Sie die Änderung der Fluoreszenzintensität in einem Bereich von etwa 200 Quadratmikrometern, um die Fasern miteinander zu vergleichen. Für jedes Bild sollte die folgende Berechnung durchgeführt werden: Delta F geteilt durch F null, wobei F null die mittlere Fluoreszenz des interessierenden Bereichs im ersten aufgezeichneten Bild darstellt und Delta F die Änderung der Fluoreszenz in jedem nachfolgenden Bild ist.

Transfizieren Sie Zellen mit Plasmid-DNA, die GFP MG 53 exprimiert, mithilfe standardisierter Methoden. Bereiten Sie anschließend die Mikropipetten vor. Legen Sie eine Pyrex-Kapillare auf eine Mikropipette.

Ziehen und Ziehen nach voreingestelltem Programm. Befestigen Sie die Mikropipette an einem dreidimensionalen Mikromanipulator. Das Medium wird aus der Delta-T-Schale entfernt und durch Tyro-Puffer mit 2,5 mmol/l Kalzium ersetzt.

Platzieren Sie die Schale mit transfizierten Zellen auf einem laser-scanning konfokalen Mikroskop mit einer 40x/1,3-NA-Ölimmersionsobjektivlinse. Verursachen Sie akute Schäden an lebenden Zellen, indem Sie die Mikropipette in die Zellmembran einführen und sie anschließend schnell wieder aus der Zelle zurückziehen. Erfassen Sie aufeinanderfolgende Bilder lebender Zellen in einem Intervall von 1,54 Sekunden pro Bild für die durch Troponin induzierte Membranruptur.

PERFU 0,005 % Troponin mit einer Rate von etwa einem Milliliter pro Minute direkt über die Zelle, die abgebildet wird. Laufband kann verwendet werden, um eine Verringerung der Laufkapazität zu messen. Die hier gezeigten MG-53-Knockout-Mäuse weisen aufgrund von Schäden am Skelettmuskel eine verminderte Laufkapazität auf.

Das Ausmaß der durch den UV-Laser verursachten Schädigung hängt von der Membranreparaturkapazität der beobachteten Faser ab. Hier ist eine Faser vor der Verletzung bei einer normalen Maus. Dieses Bild wurde 200 Sekunden später aufgenommen und zeigt eine leichte Verletzung.

Eine Muskelzelle, die von MG-53-Knockout-Mäusen mit beeinträchtigter Membranreparaturkapazität stammt, zeigt nach einer Verletzung einen stärkeren Farbstoffeintritt. Hier sehen Sie ein Beispiel für eine intakte GFP-MG-53-transfizierte C2C12-Myotube. Der Pfeil in dieser Aufnahme zeigt auf GFP-MG-53-haltige Vesikel, die sich in Richtung der Schadensstellen bewegen.

In diesem Beispiel wurde Saponin verwendet, um die Plasmamembran zu schädigen. Beachten Sie die Translokation von GFP MG 53 vom Cytosol zur Zellmembran nach der Verletzung. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, gute Muskelzellfasern mit glatten Sarkolemmen und klaren Streifungsmustern zu isolieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Membranreparaturkapazität von Muskelzellen und die Kultur der Zellen beurteilt werden kann.