A Simple hängenden Tropfen Cell Culture Protokoll zur Generierung von 3D-Sphäroide

Das Ziel dieses Experiments besteht darin, steroidartige dreidimensionale Gewebe zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst kultivierte Zellen gewonnen und anschließend eine Einzelzell-Suspension hergestellt wird. Danach werden Tropfen der Zellsuspension auf der Unterseite des umgedrehten Deckels einer Zellkulturschale abgesetzt.

Dann wird der Deckel auf die Hydrationskammer umgekehrt. Der letzte Schritt besteht darin, die hängenden Tropfen 24 bis 48 Stunden lang inkubieren zu lassen, damit Aggregate entstehen können. Anschließend können diese in ein schüttelndes Wasserbad überführt und bis zu fünf weitere Tage inkubiert werden.

Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die Unterschiede in der Aggregatadhäsion oder Zellsortierung durch Kompressionsassays, Gewebeoberflächen-10-Symmetrie oder Epi-Fluoreszenzmikroskopie zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie beispielsweise der konventionellen 2D-Gewebekultur liegt darin, dass Zellen, die in 3D kultiviert werden, die zellulären Interaktionen, wie sie in einem Gewebeumfeld auftreten, genauer nachahmen. Ich werde diese Methode demonstrieren, um Ihnen zu zeigen, dass sie so einfach ist, dass sogar ein Projektleiter sie durchführen kann.

Um dieses Experiment zu beginnen, gewinnen Sie Anheftungszellen bei 90 % Konfluenz. Aspirieren Sie zunächst das Kulturmedium und spülen Sie die Zellschicht zweimal mit PBS. Danach entfernen Sie den PBS und pipettieren zwei Milliliter einer 0,05 %igen Trypsin-Lösung in EDTA-Lösung auf die Zellschicht.

Stellen Sie die Platte in den 37 Grad Celsius warmen Zellkultur-Inkubator und inkubieren Sie, bis sich die Zellen ablösen. Entfernen Sie danach die Platte aus dem Inkubator und stoppen Sie die Detachierung. Geben Sie zwei Milliliter komplettes Medium hinzu.

Verwenden Sie eine 5-mL-Pipette, um die Mischung so lange zu tritrieren, bis die Zellen vollständig in Suspension sind. Überführen Sie dann die Zellsuspension in ein 15-mL-Konischgefäß. Pipettieren Sie 40 µL einer 10 mg/mL-DNA-Lösung in die Zellsuspension und inkubieren Sie sie fünf Minuten bei Raumtemperatur nach der Inkubation.

Vortexen Sie die Zellsuspension kurz und zentrifugieren Sie sie anschließend fünf Minuten lang mit 200 × g. Nach Beendigung der Zentrifugation den überstehenden Überstand S absaugen und verwerfen, dann das Pellet zur Wäsche in einem Milliliter vollständigem Medium resuspendieren. Wiederholen Sie die Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet erneut in einem Milliliter vollständigem Medium.

Führen Sie anschließend eine Zellzählung mit einem automatisierten Zellzähler oder einem Hämocytometer durch. Stellen Sie die Zellsuspension mit Medium auf eine Endkonzentration von 2,5 × 10⁶ Zellen pro Milliliter ein. Danach fahren Sie mit der Bildung hängender Tropfen fort.

Bereiten Sie eine Hydrationskammer vor, indem Sie den Deckel einer 60-Millimeter-Zellkulturschale entfernen und fünf Milliliter PBS in den Boden der Schale pipettieren. Drehen Sie den Deckel der Schale um und pipettieren Sie bis zu 20 Tropfen mit je 10 Mikroliter Zellsuspension auf die Unterseite des Deckels. Stellen Sie sicher, dass die Tropfen ausreichend voneinander entfernt platziert werden, sodass sie sich nicht berühren.

Setzen Sie den Deckel mit den Tropfenkulturen vorsichtig wieder auf den Boden der Schale, die PBS enthält. Stellen Sie die Kulturplatte in einen Zellkultur-Inkubator. Stellen Sie auf 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und 95 % Luftfeuchtigkeit ein und inkubieren Sie über Nacht.

Überwachen Sie die Tropfen täglich und setzen Sie die Inkubation fort, bis sich Zellplatten oder Aggregate gebildet haben. Sobald sich Zellplatten oder Aggregate gebildet haben, überführen Sie diese in Rundkolben aus Glas mit einem Fassungsvermögen von drei Milliliter komplettem Medium. Inkubieren Sie die Flaschen mit den Zellplatten oder Aggregaten in einem schüttelnden Wasserbad.

Bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid etwa 24 Stunden lang inkubieren, bis Steroide unter einem Stereomikroskop sichtbar werden. Sobald Steroide gebildet wurden, kann der Einfluss experimenteller Eingriffe auf die Steroidbildung gemäß dem im schriftlichen Protokoll beschriebenen Verfahren quantifiziert werden. Außerdem kann nun die Einlagerung von zuvor hinzugefügten fluoreszierenden Farbstoffen in die Membran mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden.

Dieses Hellfeldmikroskopiebild zeigt die Aggregation von Ratten-Prostatakarzinom-MLL-Zellen nach 18 Stunden Inkubation mit der Hängentropfen-Methode. Auf diesem Bild ist ein zweiter Aggregat von MLL-Zellen zu sehen, der sich nach 18 Stunden Kultur mittels der Hängentropfen-Methode gebildet hat. Diese Zellen wurden in Gegenwart von 25 Mikromolar des MEK-Inhibitors PD 9 8 0 5 9 kultiviert, was zu einem deutlich kompakteren Zellaggregat führte.

Hier wird der Unterschied zwischen der MLL-Hanging-Drop-Kultur nach Behandlung mit einem MEK-Inhibitor, der Aggregatgröße und der unbehandelten Kontrollaggregatgröße gezeigt. Der Stern (*) steht für einen statistisch signifikanten Unterschied mit einem P-Wert kleiner als 0,0001. Wie durch den Student'schen t-Test zwischen unbehandelten und mit MEK-Inhibitor behandelten Aggregaten ermittelt, deutet dies darauf hin, dass die Behandlung mit einem MEK-Inhibitor signifikant kleinere und kompaktere Aggregate bewirkt.

Dieses Bild wurde mit einem Nikon-Smz-800-Stereomikroskop aufgenommen und zeigt ein Steroid, das durch Inkubation von Leberzellen aus Hühnerembryonen in Hängentropfenkultur für 18 Stunden gebildet wurde, gefolgt von einer Inkubation in einem schüttelnden Wasserbad bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden. Diese konfokale Mikroskopieaufnahme veranschaulicht das Sortierverhalten, das auftritt, wenn bestimmte Zellpopulationen mittels der Hängentropfenmethode gemeinsam kultiviert werden. Vor der Hängentropfenkultur wurden die Leberzellen aus Hühnerembryonen mit dem Membranfarbstoff pkh zwei und Hühnerembryonen.

Herzzellen wurden mit PKH 26 gefärbt. Die Zellsuspensionen wurden anschließend gemischt und als Hänge-Tropfen kultiviert. Die Kultur wurde 18 Stunden lang durchgeführt, gefolgt von einer 48-stündigen Inkubation im schüttelnden Wasserbad bei 37 Grad Celsius.

Man erkennt anhand des optischen Schnitts, dass die gelb gefärbten Herzzellen von Leberzellen umhüllt sind. Hier pseudofarben blau dargestellte zwei Nardi- und transfizierte L-Zellklone, die NCA auf ihrer Oberfläche exprimieren. Im Verhältnis von 2,4 zu 1 wurden mit den fluoreszierenden Membranfarbstoffen PKH2 und PKH26 in gleichen Anteilen gefärbt und wie zuvor als Hänge-Tropfen kultiviert.

In diesem Beispiel werden die Zellen mit hohem Cadherin-Ausdruck, die grün pseudofärbig dargestellt sind, von Zellen umgeben, die niedrigere Mengen an Cadherin exprimieren und rot pseudofärbig dargestellt sind. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in 30 Minuten oder weniger durchgeführt werden.