Transmembrandomäne Oligomerisierung Anschaffungsneigung durch ToxR Assay ermittelt

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Ligamentierungstendenzen von Proteinen, transmembranen Domänen oder TMDs in einer natürlichen Membranumgebung zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem die gewünschte transmembrane Domäne in E. coli als chimäres Protein mit Maltose-Bindungsprotein für die Lokalisation in den Periplasma- und ToxR als transkriptionellen Reporter exprimiert wird. Die durch die transmembrane Domäne induzierte Ligamentierung führt zur Dimerisierung von ToxR und zur Aktivierung der LXi-Transkription. In einem zweiten Schritt werden die Zellen lysiert und mit ONPG behandelt, das durch Beta-Galacto zur lichtabsorbierenden Spezies O-Nitro-Phenolat oder ONP hydrolysiert wird.

Die nächsten ONP-Stufen werden durch Messung der Lichtabsorption bei 405 Nanometern quantifiziert. Um die Stufen der Transmembrandomäne zu bestimmen, zeigen Ligamentisierungsergebnisse die Ligamentisierungsneigung der Transmembrandomänen basierend auf einem tox R-Reporter-Assay. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden biophysikalischen Methoden wie SDS-Page oder Fluoreszenz besteht darin, dass das Verhalten der Transmembrandomäne in einer natürlichen Phospholipiddoppelschicht durch Expression in E. coli und nicht in einem membranmimetischen System wie einem Detergens selbst untersucht wird.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Membranproteine zu beantworten, beispielsweise die Aufklärung wichtiger struktureller Merkmale, die an der Transmembran-Helix-Assoziation beteiligt sind. Vor Beginn dieses Protokolls werden sieben Plasmide, die das benötigte chimäre Protein exprimieren, aus kommerziell synthetisierten Oligonukleotiden hergestellt, die die gewünschte TDS darstellen, flankiert von NHE1 und BMH1. Restriktionsstellen, nachdem die Plasmide vorbereitet wurden, vorsichtig fhk12 kompetente Zellen auf Eis auftauen. Sobald die Zellen aufgetaut sind, überführen Sie sie in 15-Milliliter-Kulturröhrchen und geben 200 Nanogramm jeder Plasmid-DNA in ein separates Röhrchen. Inkubieren Sie die Zellen anschließend 30 Minuten lang auf Eis.

Danach die Zellen 90 Sekunden lang bei 42 Grad Celsius harschen, gefolgt von einer zweiminütigen Inkubation auf Eis in 800 Mikroliter SOC-Medium; anschließend die Proben eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius unter Schütteln inkubieren. Nach der Inkubation jeweils fünf Milliliter LB-Medium, das Chloramphenicol enthält, mit 50 Mikroliter der Transformationsmischung ansämen, und dies für jede Probe in dreifacher Ausführung in 15-Milliliter-Kulturröhrchen durchführen. Abschließend die Proben 20 Stunden lang bei 37 Grad Celsius unter Schütteln inkubieren. Um die vollständige Ligamentierung zu messen, wird die TDS-Beta-Galactosidase-Aktivität bestimmt.

Heizen Sie zunächst das Plattenlesegerät auf 28 Grad Celsius vor. Bereiten Sie frische Z-Puffer-Lösungen unter Verwendung des Z-Puffer-Stamms gemäß der schriftlichen Anleitung vor. Überführen Sie den Z-Puffer-Chloroform aus dem Reaktionsgefäß in das Reservoir, wobei Sie sicherstellen müssen, dass nur die obere wässrige Phase des Z-Puffer-Chloroforms pipettiert wird.

Stellen Sie die 96-Well-Platte auf ein Blatt Papier mit einem eingezeichneten Raster, um eine genaue Pipettierung zu gewährleisten. Geben Sie 100 µL Z-Puffer-Chloroform in jedes Loch einer 96-Well-Platte, gefolgt von jeweils fünf µL der Kultur im Vierfachen. Lassen Sie die Kultur in den vier Löchern weg, die als Blindwerte dienen sollen. Messen Sie den OD595 der Platte, um die Zelldichte zu bestimmen.

Fügen Sie 50 Mikroliter Z-Puffer-SDS zu allen Vertiefungen der Platte hinzu. Schütteln Sie dann die Platte im Plattenreader 10 Minuten lang, um die Zellen nach der Zelllyse mit 50 Mikrolitern ZPA für ONPG in allen Vertiefungen zu lysieren. Stellen Sie die Platte zurück in den Plattenreader und messen Sie die OD 4 0 5 alle 30 Sekunden über einen Zeitraum von 20 Minuten.

Bestimmen Sie die Aktivität von Beta-Lacto-Sase durch Berechnung der Miller-Einheiten, normiert auf die Blindprobe. Eine Western-Blot-Analyse wird durchgeführt, um die äquivalente Proteingexpression zwischen den Konstrukten zu überprüfen. Mischen Sie zunächst 50 µL der dreifachen Kulturen und zentrifugieren Sie die Proben anschließend in einer Mikrozentrifuge.

Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren und resuspendieren Sie das verbleibende Pellet in zweifachem Probeladepuffer. Laden Sie 7,5 Mikroliter jeder Probe auf ein standardmäßiges 8%-Gel und führen Sie die Elektrophorese eine Stunde und fünf Minuten lang bei 125 Volt durch, nachdem die Übertragung erfolgt ist. Inkubieren Sie die Membran mit einem mit Anti-M-V-P-H-R-P konjugierten Antikörper, um das chimäre Protein bei etwa 70 Kilodalton sichtbar zu machen, wobei manchmal Abbauprodukte bei etwa 48 Kilodalton zu beobachten sind.

Endogenes MVP wird ebenfalls bei 45 Kilodalton beobachtet. Um die korrekte Membraneinlagerung des chimären TMD-Konstrukts zu überprüfen, wird der auf Maltose-bindendes Protein defiziente PD28-Zellstamm verwendet, der in Minimalmedium mit Maltose als einziger Kohlenstoffquelle kultiviert wird; nur Zellen, die ein membranintegrales Expressionsprodukt mit korrekt im Periplasma lokalisiertem Maltose-bindendem Protein exprimieren, können wachsen. Transformieren Sie die PD28-Zellen wie für die fhk12-Zellen beschrieben und impfen Sie zwei Milliliter LB-Medium an.

Züchten Sie die Zellen nach der Inkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 300 U/min. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und waschen Sie sie durch Resuspendierung in zwei Millilitern PBS und vorsichtiges Pipettieren mit einer großen Spitze. Nach dem erneuten Pelletieren waschen Sie die Zellen ein zweites Mal mit PBS, führen anschließend eine endgültige Zentrifugation durch und resuspendieren in einem Milliliter PBS.

Verwenden Sie 25 Mikroliter der resuspendierten Zellen, um fünf Milliliter Minimalmedium zu beimpfen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius mit Schütteln für 15 Stunden. Überführen Sie 200 Mikroliter jeder Probe in eine 96-Well-Platte und nehmen Sie die OD595-Lesung mit dem Plattenreader vor.

Wiederholen Sie diesen Vorgang alle zwei Stunden, bis 25 Stunden erreicht sind. Die Neigung zur vollständigen Ligamentierung einzelner Transmembrandomänen des mehrfach die Membran durchspannenden integralen Proteins Latent Membrane Protein 1 wurde mittels des toxR-Transkriptionsreporter-Assays analysiert. Die Transmembrandomäne fünf weist eine starke Neigung zur Ligamentierung auf, wie durch hohe Miller-Einheiten gezeigt, was mit der positiven Kontrolle GPAA, einer etablierten dimerisierenden Sequenz, vergleichbar ist.

Eine schädliche Mutation in der Transmembrandomäne fünf D1 50A verringert die Fähigkeit der Sequenz, LMP1 zu oligomerisieren. TM1 oligomerisiert nicht signifikant und zeigt ein sehr geringes Miller-Einheit-Signal, das nur geringfügig über dem Signal der Kontrolle liegt, bestehend aus nicht transformierten FHK12-Zellen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man bestimmen kann, ob eine Transmembranhelix von Interesse die Fähigkeit besitzt, höhere Komplexe in einer natürlichen Membranumgebung zu bilden. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, äußerst sorgfältig in die 96-Well-Platte zu pipettieren, um große Fehler zu vermeiden, und sicherzustellen, dass keine Luftblasen eingebracht werden.