Eine einfache und effiziente Methode, um Makrophagen aus Mixed primären Kulturen von adulten Leber Zellen zu isolieren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, mehrere Makrophagenkulturen aus gemischten primären Kulturen von Rattenleberzellen zu gewinnen, ohne komplexe Ausrüstung oder spezielle Fähigkeiten zu benötigen. Dies wird zunächst durch die Dissoziation von Leberzellen erwachsener Ratten mittels Kollagenase-Perfusion erreicht, gefolgt von der Isolierung der parenchymalen Hepatozyten-Fraktion. Anschließend werden die Zellen in T-75-Zellkulturgefäßen mit Wachstumsmedium inkubiert, um gemischte primäre Leberzellkulturen anzulegen.

Danach werden die Kulturgefäße nach 10 bis 12 Tagen Kultivierung geschüttelt, um die Übertragung der Makrophagen auf Kunststoffschalen zu erleichtern, von denen sie anschließend nach einer kurzen Inkubationsphase durch selektive Adhärenz gewonnen werden. Schließlich können mehr als 10 der sechs Zellen wiederholt aus denselben T-75-Zellkulturgefäßen im Abstand von zwei bis drei Tagen über einen Zeitraum von mehr als zwei Wochen gewonnen werden. Isolationsmethoden für Lebermakrophagen sind ausführlich beschrieben worden.

Jedoch erfordern die meisten bisherigen Methoden aufwendige Geräte, wie einen Zentrifugal-Illustrator, und ausgefeilte technische Fähigkeiten. Hier stellen wir eine einfache und neuartige Methode vor, um Lebermakrophagen in ausreichender Zahl und Reinheit aus gemischten primären Kulturen erwachsener umhüllter Leberzellen zu gewinnen, die keiner speziellen Ausrüstung oder fortgeschrittener Laborkenntnisse bedarf. Die Tiersektion, die Leberperfusion und die Zellpräparation werden von den Ärzten Norco, Yamanaka und Miko Yoshioka am Nationalen Institut für Tiergesundheit demonstriert.

Danach wird Dr. Taketo Takeno vom Nationalen Institut für Agrarbiowissenschaften die Isolierung und Reinigung von Lebermakrophagen aus Kulturgefahren demonstrieren. Beginnen wir also. Um die Perfusion der Rattenleber vorzubereiten, erwärmen Sie zunächst eine Flasche Waschlösung und eine Flasche Kollagenaselösung vor.

Danach nach Bestätigung der Sedierung durch eine Hautquetschung einen anästhesierten erwachsenen männlichen Rat in einer Edelstahlschale platzieren und 70 %igen Ethanol auf den Bauch und die Brust sprühen. Anschließend mit einer Präzisionsschere einen kleinen Schnitt in der Mitte des Bauches machen und die Haut zurückklappen. Danach den Bauch mit der Schere öffnen und die Lage der Pfortader bestätigen.

Als Nächstes führen Sie den chirurgischen Faden unter die Pfortader und ziehen den Faden locker an. Danach klemmen Sie den distalen Teil der unteren Hohlvene und der mesenterialen Vene mit einer feinen Klemme ab, um einen Blutrückfluss in die Leber zu verhindern. Öffnen Sie die Brusthöhle, indem Sie das Zwerchfell mit einer Schere durchtrennen, und setzen Sie nach einer kleinen Inzision in der Pfortader mit Augenchirurgieschere einen zwei Millimeter großen Kunststoffkatheter in die Vene ein und ziehen den Faden fest um den Katheter.

Füllen Sie ein Perfusionsystem mit der vorgewärmten Spüllösung und verbinden Sie es anschließend mit dem Katheter. Beginnen Sie die Perfusion in C zwei mit einer Geschwindigkeit von 10 Milliliter pro Minute. Gleichzeitig schneiden Sie mit der Präzisionsschere eine Öffnung in die Wand des rechten Vorhofs.

Führen Sie die Perfusion 10 Minuten lang fort, wechseln Sie dann die Perfusionslösung zur Kollagenase-Lösung und perfundieren Sie 10 bis 20 Minuten lang. Füllen Sie bei einem Fluss von 10 Milliliter pro Minute einen sterilen Becher mit 25 Milliliter Kollagenase-Lösung. Entfernen Sie dann die perfundierte Leber und legen Sie sie vorsichtig in den Becher.

Den Leber mit einer Schere in kleine Stücke zerkleinern. 75 Milliliter kaltes MEM zur resultierenden Zellsuspension hinzufügen. Nach vorsichtigem Pipettieren die Suspension durch einen 100-Mikrometer-Zellsieb filtern.

Um das Bindegewebe in den undigested Gewebefragmenten zu entfernen, sammeln Sie das Filtrat in 50-Milliliter-Konischgefäßen. Überführen Sie das Filtrat in 50-Milliliter-Konischgefäße und waschen Sie die Zellen viermal, indem Sie die Zellen zunächst bei 50 Gs für eine Minute bei vier Grad Celsius abzentrifugieren. Mit der Bremse ausschalten, entfernen Sie vorsichtig das Überstand und resuspendieren anschließend das Pellet in kaltem MEM, bevor Sie die Zellen nach der letzten Wäsche erneut abzentrifugieren.

Suspendieren Sie die Leberzellen erneut in Wachstumsmedium. Impfen Sie die Zellen nun in fünf bis zehn T-75-Zellkulturgefäßen mit einer Dichte von 6,7 × 10⁴ Zellen pro Quadratzentimeter aus. Stellen Sie die Kulturgefäße in einen Inkubator und wechseln Sie das Wachstumsmedium alle zwei bis drei Tage.

Nach einem Tag der Kultur breiten sich die parenchymalen Hepatozyten auf der Flächenoberfläche des Kolbens aus und zeigen eine typische polygonale, kieselsteinartige Morphologie mit einem oder zwei runden Kernen. Innerhalb weniger Tage verlieren die parenchymalen Hepatozyten ihre epitheliale Zellmorphologie und wandeln sich in stärker abgeflachte, fibroblastenähnliche Zellen um. Um Tag sechs herum beginnen sich unter Phasenkontrastmikroskopie helle, runde, makrophagenähnliche Zellen auf dem Blatt der fibroblastenähnlichen Zellen zu vermehren. Das Wachstum der makrophagenähnlichen Zellen erreicht um Tag 12 herum sein Maximum.

Die Anzahl an makrophagenähnlichen Zellen nimmt um Tag 19 herum ab, wenn das fibroblastische Zellblatt zu degenerieren beginnt. Daher suspendieren wir nach etwa sieben bis zehn Tagen Kultur die Makrophagen, die auf dem Zellblatt proliferiert haben, durch 30-minütiges Hin-und-her-Schütteln der Kulturgefäße für 30 Minuten nach der Resuspension in das Kulturmedium. Befüllen Sie jede der 100 Millimeter großen nicht-tissuekulturgeeigneten Kunststoffschalen mit dem Medium aus zwei T-75-Flaschen.

Füllen Sie die Kulturgefäße erneut mit Wachstumsmedium auf und stellen Sie sie in den Inkubator zurück. Inkubieren Sie die Kunststoffschalen 30 Minuten nach der Inkubationszeit, waschen Sie die Schalen dreimal, indem Sie das Medium absaugen und die Kunststoffschale vorsichtig mit PBS spülen, wie hier gezeigt, bereits 10 Minuten nach der Aussaat, wobei makrophagenähnliche Zellen an der Oberfläche der Schale haften, während andere kontaminierende fibroblastische Zellen in Suspension verbleiben. Nach dem PBS-Spülvorgang erhält man eine hochreine Makrophagenpopulation.

Wie in dieser Abbildung zu sehen ist, nehmen die Zellen nach 40 Minuten Kultivierung eine typische Makrophagen-Morphologie an, und mitotische Zellen werden häufig beobachtet, wie durch die Pfeile angezeigt. Um diese neu gewonnene hochreine Makrophagen-Population zu gewinnen, geben Sie ein Milliliter trip-LE-Express-Lösung zu den gewaschenen Zellen hinzu und stellen die Schalen weitere 10 Minuten in den Inkubator. Nach dieser Inkubationszeit fügen Sie neun Milliliter Wachstumsmedium hinzu, lösen vorsichtig die anhaftenden Makrophagen mit dem Zellabstreifer ab, überführen sie in ein 15-Milliliter-Kegelrohr, zentrifugieren und verwerfen den Überstand.

Geben Sie ein Milliliter des Wachstumsmediums hinzu, dissoziieren Sie die resuspendierten Zellklumpen durch kräftiges Pipettieren in Einzelzellen, und bestimmen Sie die Zellzahl mittels Hämozytometer, wie in diesem Diagramm dargestellt. Mehr als 10⁶ Zellen können wiederholt im Abstand von zwei bis drei Tagen über einen Zeitraum von mehr als zwei Wochen aus einem T75-Kulturkolben gewonnen werden, was eine Gesamtausbeute von 10⁷ Zellen pro T75-Kulturkolben ermöglicht. Wie in diesen Bildern gezeigt, werden die isolierten Zellen mit monoklonalen Antikörpern gegen Rattenmakrophagen-Antigene wie CD68 oder ED1 sowie CD172a oder OX41 immunhistochemisch gefärbt. Diese Zellen weisen funktionelle Eigenschaften von Makrophagen auf, wie beispielsweise die aktive Phagozytose von FITC-markierten Mikroperlen.

In diesem Video stellen wir eine einfache und effiziente Methode zur Gewinnung von Makrophagen aus gemischten primären Kulturen adulter roter Leberzellen vor. Unser Verfahren erfordert keine komplexen Geräte oder besonderen Fähigkeiten, liefert aber dennoch ausreichende Mengen reiner Makrophagen, die wiederholt aus derselben Kultur von Brass gewonnen werden können. Diese Methode kann auf andere Säugetierarten angewendet werden.

Vielen Dank fürs Anschauen des Videos und viel Erfolg bei Ihren zukünftigen Experimenten. Prost.