Optimiertes Protokoll für die effiziente Transfektion von dendritischen Zellen ohne Zell-Reifung

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Expression eines Zielgens in DCS mittels SI-RNA-Transfektion zu verringern. Dies wird erreicht, indem zunächst der AM Maxin Nucleo-Effektor programmiert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, DCS und siRNA miteinander zu mischen und die resultierende Zellsuspension in Nucleo QVE-Module pipettieren.

Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Platte in das Amaxa-Shuttle-Behältnis einzusetzen, um den Transfektionsprozess zu starten. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Infektion der Zellen mit dem Virus, um die Interferonantwort zu aktivieren. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die den Gen-Knockdown mittels quantitativer RT-PCR und Western Blotting zeigen.

Diese Technik ist wertvoll zur Charakterisierung von Signalwegen in dendritischen Zellen und könnte zur Entwicklung dendritischer zellbasierter Immuntherapien beitragen. Um den Maxon 96-Well-Shuttle-Nukleofaktor für die DC-Transfektion zu programmieren, öffnen Sie eine neue Parameterdatei. Wählen Sie die Anzahl der Wells, die Sie für die Standardtransfektion verwenden werden, aus, indem Sie den Cursor über das Diagramm der 96-Well-Platte ziehen.

Verwenden Sie mindestens drei Vertiefungen, um sie für jede experimentelle Probe zu vereinen. Geben Sie nun den Programmcode ein: Wählen Sie im ersten Teil F, F und im zweiten Teil i, wählen Sie 1 68 aus den Dropdown-Menüs. Wählen Sie dann im Lösungsfeld Monocyte Human, anschließend unter Kontrolloption Standard und klicken Sie dann auf Übernehmen.

Um eine Kontrolle ohne Transfektion einzuschließen, müssen zusätzliche Vertiefungen aus dem Diagramm ausgewählt werden. Anschließend wählen Sie unter den Kontrolloptionen die „kein Programm-Steuerung“ und klicken erneut auf „Übernehmen“. Nach dem Mischen der Nukleofektionslösung lassen Sie diese auf Raumtemperatur erwärmen.

Platzieren Sie die benötigte Anzahl an Nucleo VETE-Modulen in der Nucleo VETE-Platte in der hier gezeigten korrekten Ausrichtung, indem Sie das erste Modul in die Vertiefungen eins und zwei einführen und dies anschließend für alle folgenden Röhrchen fortsetzen. Überführen Sie eine ausreichende Menge an DCS aus einem Zellkulturgefäß in ein 50-Milliliter-Röhrchen, um 500.000 Zellen pro Vertiefung für die Transfektion zu erhalten; zentrifugieren Sie die Zellen 10 Minuten bei 400 ×g und 4 °C und entfernen Sie anschließend vorsichtig den Überstand. Geben Sie danach Nuklear-Affektionslösung in das Röhrchen und resuspendieren Sie die DCS, indem Sie diese mehrmals vorsichtig auf- und abpipettieren.

Etikettieren Sie nun die Eppendorf-Röhrchen gemäß der jeweils durchzuführenden Behandlung und verteilen Sie die resuspendierten Zellen auf die beschrifteten Röhrchen. Geben Sie SI-RNA in einer Endkonzentration von 0,25 Mikrogramm pro 500.000 Zellen zu den entsprechenden Eppendorf-Röhrchen hinzu und mischen Sie die Zellsuspensionen durch Pipettieren. Verwenden Sie eine nicht-zielgerichtete SI-RNA für die Kontrollprobe ohne Transfektion.

Pipettieren Sie anschließend 20 Mikroliter der SI RA DC-Zellsuspension entsprechend dem zuvor programmierten experimentellen Layout in die Nucleo Vete-Module, wobei sichergestellt werden muss, dass die Flüssigkeit am Boden der Vertiefung abgegeben wird. Decken Sie die Nucleo Vete-Platte mit einem Deckel ab und klopfen Sie die Platte mehrmals auf eine harte Oberfläche, um die Entfernung von Luftblasen zu erleichtern, um die Dendritischen Zellen (DCs) zu transfizieren. Setzen Sie die vorbereitete Nucleo Yvette-Platte in das Nucleo Effector 96-Well-Shuttle-Behältnis ein. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche „Hochladen und Starten“.

Verfolgen Sie den Fortschritt des Transfektionsprozesses auf dem Display. Ein schwarzes Kreuz auf grünem Hintergrund kennzeichnet eine erfolgreiche Transfektion in dieser Vertiefung, während ein schwarzer Balken auf rotem Hintergrund eine erfolglose Transfektion anzeigt, während die Zellen transfiziert werden. Erwärmen Sie das DC-Wachstumsmedium vor, sobald der Transfektionsprozess abgeschlossen ist, nehmen Sie die Platte heraus und geben Sie 80 Mikroliter des vorgewärmten DC-Wachstumsmediums in jede Vertiefung.

Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette und inkubieren Sie die Platte nun 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Während der Inkubationszeit geben Sie 100 Mikroliter des vorgewärmten DC-Wachstumsmediums in die Matrixröhren in derselben Anordnung wie die Nukleoküvettenplatte. Nach Ablauf der Inkubationszeit überführen Sie alle 100 Mikroliter der Zellsuspensionen aus den Nukleo-CVEs in die vorbereiteten Matrixröhren.

Entfernen und entsorgen Sie anschließend die Röhrchen, in denen keine Transfektion stattgefunden hat. Inkubieren Sie die Matrix-Röhrchen abschließend 24 Stunden oder einen anderen gewünschten Zeitraum. Beschriften Sie jeweils ein Eino-Röhrchen für jedes inkubierende Matrix-Röhrchen.

Überführen Sie anschließend die Matrixröhren aus dem Inkubator in eine Zellkulturhaube und vereinigen Sie die Matrixröhren für jede experimentelle Probe in vorbeschriftete eend dfs. Danach pelletieren Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie die eend DPH-Röhrchen 10 Minuten lang in einer Tischzentrifuge bei 400 ×g zentrifugieren. Entfernen Sie anschließend den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in serumfreiem Wachstumsmedium, das Newcastle-Disease-Virus (NDV) mit einer MOI von eins enthält.

Decken Sie die epi-Endorphine steril ab und inkubieren Sie die Röhrchen 45 Minuten lang. Fügen Sie nach dieser Inkubationszeit 900 Mikroliter DC-Wachstumsmedium hinzu und inkubieren Sie die Röhrchen erneut für acht bis zehn Stunden. Zum Ernten der transfizierten und infizierten DCs.

Die Zellen durch Zentrifugieren der Eppendorfgefäße in einer Tischzentrifuge wie zuvor pelletieren und den Überstand entfernen. Monozyten-Dendritische Zellen wurden entweder mit siRNA, die RIG-I targetet, oder mit unspezifischer Kontroll-siRNA transfiziert und wie durch ein Pluszeichen angegeben mit NDV infiziert oder blieben wie durch ein Minuszeichen angegeben unbehandelt. Eine Knockdown-Effizienz von RIGA um 75 % auf Transkriptionsebene wurde beobachtet, wobei eine ähnliche Reduktion der Expression von Interferon-beta festgestellt wurde. Eine verringerte Expression von Interferon-beta, einem downstream wirksamen Effektor von RIGA in der Interferon-Signaltransduktionskaskade, wurde ebenfalls nachgewiesen. Darüber hinaus war die Expression von Interferon-beta in nicht infizierten, kontrolltransfizierten Zellen nicht nachweisbar.

Während die von MXA und dem Interferon-beta-abhängigen Antwortgen war minimal. Hier sind Daten aus einer zweiten Transfektion von DZS mit RIG-I-zielgerichteter iRNS gezeigt, die wie in der vorherigen Abbildung durchgeführt wurde. Alle Zellen wurden jedoch mit NDV infiziert, und als zusätzliche Kontrolle wurden unresezierte monocyten-DZS verwendet.

Die Ergebnisse der Gen-Silenzierung waren ähnlich wie in der vorherigen Abbildung beobachtet. Eine Westernblot-Analyse mit Antikörpern gegen RGA zeigte, dass die Proteinexpression dieses Gens vollständig blockiert worden war. Die Gelen 1 und 2 zeigen Daten für Lysate aus nicht resezierten Zellen.

Die Bahnen drei und vier zeigen Lysate aus Zellen, die mit glow irna transfiziert wurden, und die Bahnen fünf und sechs zeigen Lysate aus Zellen, die mit RIG I-zielgerichteter S irna transfiziert wurden. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb einer Stunde durchgeführt werden, einschließlich des Knockdowns vieler Gene gleichzeitig.