Erzeugung und Kennzeichnung von Murine Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen mit Qdot Nanokristalle für Tracking-Studien

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, dendritische Zellen mithilfe von Q-Dot-Nanokristallen für bildgebende Untersuchungen vorzubereiten. Dies wird erreicht, indem zunächst Knochenmarkszellen aus murinen Femora und Tibiae isoliert werden. Anschließend werden Knochenmarkszellkulturen angelegt, um die Differenzierung der Zellen in dendritische Zellen in Gegenwart von GM-CSF zu fördern.

Anschließend werden die dendritischen Zellen nach acht Tagen aus den Knochenmarkzellkulturen gewonnen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zellen mit fluoreszierenden Q-Nanokristallen anzufärben. Letztendlich können hell angefärbte dendritische Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden.

Der Hauptvorteil dieser Technologie im Vergleich zu anderen Methoden, wie der Verwendung von GFP-markierten dendritischen Zellen, liegt darin, dass Q-Dot-Nanokristalle ihre Fluoreszenz auch nach der Färbung mit organischen Lösungsmitteln wie Aceton beibehalten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Biologie dendritischer Zellen zu beantworten, beispielsweise bezüglich der Migrationsfähigkeit dieser Zellen bei verschiedenen Erkrankungen oder im Kontext unterschiedlicher Krankheitsbilder. Die Färbeprozedur wird Maria Ali, eine Doktorandin aus meinem Labor, demonstrieren.

Nach der Tötung sorgfältig die Tibia und Femora von zwei Mäusen entfernen, ohne die Knochenenden zu durchtrennen. Anschließend mit Papiertuch alle anhängenden Gewebe vorsichtig von den Knochen entfernen, wobei darauf geachtet werden muss, sie nicht zu beschädigen. In einer Sicherheitswerkbank.

Füllen Sie eine 35 Millimeter große Petrischale mit 70 % Ethanol und tauchen Sie die Knochen anschließend 10 Minuten lang in den Ethanol ein. Nach der Sterilisation entnehmen Sie die Knochen dem Ethanol und lassen sie fünf Minuten lang in einer neuen Petrischale an der Luft trocknen. Schneiden Sie nun den Femur in der Mitte und die Tibia an ihrer dünnsten Spitze durch.

Füllen Sie das Innere der Knochen mit einem Milliliter RPMI-Medium unter Verwendung einer sterilen Spritze auf. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie sie zweimal mit RPMI-Medium durch eine 10-minütige Zentrifugation bei 300 × g und vier Grad Celsius in einer Zentrifuge mit Schwenkkopfrotor. Nach dem letzten Waschschritt resuspendieren Sie die Zellen in zwei Milliliter eines CK-Lysepuffers und inkubieren sie fünf Minuten bei Raumtemperatur, um rote Blutkörperchen zu eliminieren.

Fügen Sie anschließend 13 Milliliter RPMI mit 10 % FBS hinzu und waschen Sie die Zellen zwei weitere Male in diesem Medium mit denselben Zentrifugaleinstellungen wie zuvor. Zählen Sie die Zellen und stellen Sie die Konzentration auf zwei mal 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter ein. Geben Sie rekombinantes murines G-M-C-S-F in RPMI mit 10 % FBS, um eine Endkonzentration von 20 Nanogramm pro Milliliter zu erreichen.

Gegeben Sie anschließend 10 Milliliter dieser Suspension in eine sterile mikrobiologische Qualitäts-Petrischale mit 10 Zentimeter Durchmesser und kultivieren Sie die Zellsuspension in einem Kohlendioxid-Inkubator. Drei Tage später fügen Sie jeweils weitere 10 Milliliter RPMI ergänzt mit 10 % FBS und 20 Nanogramm pro Milliliter rekombinantem murinem G-M-C-S-F zu den vorbereiteten Platten hinzu.

Drei weitere Tage später 10 Milliliter Zellsuspension von jedem Petrischale entnehmen, die Zellen unter denselben Bedingungen zentrifugieren und das Pellet in dem gleichen Volumen RPMI plus 10 % FBS resuspendieren, das von den Petrischalen gewonnen wurde, sowie mit neuem rekombinanten murinen G-M-C-S-F auffüllen. Schließlich die Zellsuspension in die jeweils ursprüngliche Petrischale zurückgeben und die Zellen weitere zwei Tage im Kohlendioxid-Inkubator kultivieren. Nach acht Tagen in Kultur die schwimmenden und locker anhaftenden Zellen durch Waschen der Petrischalen mit frischem Medium gewinnen.

Markieren Sie anschließend die gesammelten Zellen mit dem Q Tracker 655 Cell Labeling Kit, wobei die Herstelleranweisungen strikt befolgt werden müssen, um fünf mal 10 hoch 6 aus murinem Knochenmark stammende dendritische Zellen mit Q-Nanokristallen bei einer Konzentration von 10 Nanomolar zu markieren. Mischen Sie zunächst je fünf Mikroliter der Kit-Komponenten A und B in einem Eppendorf-Röhrchen und inkubieren Sie die Mischung fünf Minuten bei Raumtemperatur. Geben Sie danach ein Milliliter RPMI plus 10 % FBS hinzu und wirbeln Sie das Röhrchen 30 Sekunden lang im Vortex.

Fügen Sie anschließend fünf mal 10 hoch 5 Dcs in 0,5 Milliliter RPMI plus 10 % FBS in das Eppendorf-Röhrchen ein und inkubieren Sie die Zellen in der D-Lösung bei 37 Grad Celsius für 60 Minuten. Waschen Sie die Zellen danach zweimal in RPMI plus 10 % FBS unter den gleichen Bedingungen wie zuvor und resuspendieren Sie das Pellet in RPMI.

Diese Abbildung zeigt ein Beispiel einer fluoreszenzmikroskopischen Aufnahme von dcs. Unmittelbar nach der Markierung wurde ein Tropfen markierter Zellen auf einen Objektträger gegeben und mit einem Deckglas abgedeckt. Anschließend wurden die Proben mit einem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet.

In dieser Abbildung ist eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von DCs nach 48 Stunden sichtbar, die die Reifung in vitro zeigt. Die DCs wurden 48 Stunden lang mit 100 Nanogramm pro Milliliter LPS und 20 Nanogramm pro Milliliter TNF-α in Objektträgerkammern im Kohlendioxid-Inkubator kultiviert. Anschließend wurden die Proben mit PBS gewaschen, mit Aceton fixiert, mit DAPI kontrastgefärbt und mittels Fluoreszenzmikroskopie ausgewertet.

In vitro reifegewordene markierte DCs wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. Mit Q-Dots gefärbte Zellen zeigen ein starkes Signal im FL3-Kanal. Q-Dot-gefärbte und ungefärbte DCs wurden zusätzlich mit spezifischen Antikörpern gegen Reifungsmarker, CD86 und CD40, sowie mit Isotypkontrollen gefärbt. Anschließend wurden die Zellen durchflusszytometrisch analysiert. Zusätzlich wurden die Konzentrationen von IL-6 und Stickstoffmonoxid in Überständen reifer Q-Dot-gefärbter DCs sowie in Kontrollen bestimmt.

Hier ist eine repräsentative Abbildung von markierten DCs in einem dissezierten Gewebe dargestellt. Reife DCs wurden intravenös in C57BL/6-Mäuse injiziert. Drei Tage später wurden die Mäuse getötet und die Milzen entnommen.

Sofort eingefroren in OCT eingebettet und acht Mikrometer dicke Schnitte wurden mit einem Kryostaten hergestellt. Die Proben wurden anschließend mit Aceton fixiert, mit DPI kontragefärbt und mit einem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. Nach diesen Verfahren.

Andere Methoden wie das Antigen-Präsentieren oder die Reifung mit unterschiedlichen Stimuli können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise die Migration dendritischer Zellen als Reaktion auf verschiedene Reifungsreize.