Die Quantifizierung der Häufigkeit von Tumor-Ausbreitung Cells Mit Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngene Zebrafisch

Der Grenzverdünnungs-Koloniebildungstest ist der Goldstandard zur Beurteilung des Selbstvermehrungspotenzials in experimentellen Tiermodellen. In dieser Darstellung werden Ein-Zell-Stadium-syngäne Zebrafischembryonen mit rag zwei MIC und RAG zwei GFP injiziert, um transgene Zebrafische zu erzeugen, die eine fluoreszenzmarkierte T-Zell-akute lymphoblastische Leukämie entwickeln. Nach 60 Lebens tagen werden die primären Leukämiezellen aus den Zebrafischen isoliert und anschließend mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung gereinigt.

Anschließend werden die Zellen in limitierender Verdünnung in die Bauchhöhle erwachsener Zebrafische transplantiert, und die Fische werden bis zu 90 Tage lang auf Tumorentwicklung überwacht. Schließlich wird das statistische Softwareprogramm für die Analyse mit extremer limitierender Verdünnung verwendet, um die Häufigkeit von Leukämie-ausbreitenden Zellen innerhalb des ursprünglichen Tumors zu quantifizieren. Die Zelltransplantationsanalyse in limitierender Verdünnung ermöglicht es Forschern, die Anzahl der sich selbst erneuernden Zellen innerhalb der Gesamtmasse des Tumors genau zu bestimmen.

Es sind diese sich selbst erneuernden Zellen, die die Krebsentstehung antreiben und letztlich für das Rezidiv verantwortlich sind. Der Hauptvorteil der Durchführung von limitierenden Verdünnungs-Transplantationsassays im Zebrafisch-Modell liegt darin, dass für jedes Experiment viele Fische transplantiert werden können, was zu einer besseren Genauigkeit bei der Bestimmung der Häufigkeit von sich selbst erneuernden Tumorausbreitungszellen führt. Diese Methode liefert Einblicke in Tumorausbreitungszellen bei T-Zell-akuter lymphoblastischer Leukämie.

Es kann auch zur Untersuchung anderer Zebrafisch-Krebsmodelle angewendet werden. Jessica Blackburn, eine Mitarbeiterin im Labor, und Sally Liu, eine talentierte Technikerin, werden Ihnen heute die Methode demonstrieren. Um die Rag2-CM- und Rag2-GFP-DNA-Konstrukte zu linearisieren, digerieren Sie jeweils 10 Mikrogramm der Plasmide mit dem Restriktionsenzym NotI über Nacht bei 37 Grad Celsius. Nach Phenol-Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung lösen wir jedes Plasmid in 20 Mikroliter Wasser auf.

Bestimmen Sie die DNA-Konzentrationen auf einem 1 %igen Agarosegel, indem Sie eine Verdünnung im Verhältnis eins zu eins, eins zu fünf und eins zu zehn jedes verdauten Plasmids zusammen mit 20 Mikrolitern, 10 Mikrolitern und fünf Mikrolitern einer DNA-Leiter mit hohem Bereich laufen lassen. Verdünnen Sie nun die DNA auf eine Endkonzentration von 60 Nanogramm pro Mikroliter zur Injektion in den CG-eins-Stamm Syngen. Injizieren Sie bei Zebrafisch-Embryonen 250 Nanoliter von jeweils 30 Nanogramm pro Mikroliter rag2 CM und 30 Nanogramm pro Mikroliter.

Übertragen Sie zwei GFP in Ein-Zell-Stadium-Zebrafisch-Embryonen, wobei die DNA gezielt direkt in die Zelle und nicht in das Eigelb injiziert wird. Lagern Sie die injizierten Embryonen bei 28,5 Grad Celsius und entfernen Sie die verstorbenen Embryonen nach 24 Stunden; überführen Sie die Tiere etwa 28 Tage nach der Injektion in große Becken. Betäuben Sie larvale Zebrafische, indem Sie 200 Mikroliter einer Lösung mit vier Nanogramm pro Milliliter Trica S zu 25 Millilitern Fischaquarienwasser in einer Petrischale hinzufügen.

Untersuchen Sie die Larven auf die Entwicklung fluoreszenzmarkierter TALL, indem Sie ein Epi-Fluoreszenzmikroskop verwenden, um die GFP-Fluoreszenz nachzuweisen. Trennen Sie Larven mit positivem Tumorstatus von negativen Larven, um sicherzustellen, dass keine leukämischen Fische in der Analyse übersehen werden. Negative Larven können zu einem späteren Zeitpunkt erneut untersucht werden, sobald sich die Tumore möglicherweise vergrößert haben. Überwachen Sie die fluoreszenzmarkierten leukämischen Fische mindestens einmal wöchentlich mithilfe des Epi-Fluoreszenzmikroskops, um das Tumorwachstum zu verfolgen.

Wenn GFP-positive Leukämiezellen mehr als 50 % des Tieres befallen haben, geben Sie ein Milliliter einer Lösung mit vier Nanogramm pro Milliliter Trica S in eine Petrischale, die neun Milliliter Fisch-Systemwasser enthält, um den Fisch zu töten. Legen Sie den Fisch in eine neue Petrischale, die ein Milliliter 5 % fetalem Rinderserum in 0,9-fach PBS enthält. Makernieren Sie den Fisch mit einer Rasierklinge und pipettieren Sie die Mischung, um große Zellklumpen aufzulösen. Anschließend lassen Sie die Zellen durch ein 40-Mikrometer-Netzfilter in ein 50-Milliliter-Röhrchen laufen.

Pipettieren Sie 500 Mikroliter der Zellen in ein vier Milliliter fassendes Polystyrolröhrchen. Geben Sie ein Mikroliter einer Lösung mit einem Milligramm pro Milliliter Peridinin-Iodid hinzu, um tote Zellen zu markieren, wirbeln Sie die Probe kurz durch und stellen Sie sie anschließend auf Eis. Bereiten Sie außerdem eine Wildtyp-CG1-Fischprobe vor, um normale Blutzellen zu gewinnen, die als Träger für die Tumorzellen während der Transplantation dienen. Geben Sie vier Milliliter einer 5 % FBS in 0,9 X PBS enthaltenden Lösung in ein 50-Milliliter-Röhrchen, um ein Gesamtvolumen von fünf Millilitern zu erreichen.

Zählen Sie die normalen Blutzellen, verdünnen Sie diese auf drei mal 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter in 5 % FBS in 0,9 x PBS, und pipettieren Sie anschließend 100 Mikroliter pro Vertiefung einer 96-Loch-Platte. Verwenden Sie einen fluoreszenzaktivierten Zellsortierer, um GFP-positive, PI-negative Tumorzellen in die 96-Loch-Platte mit den Blutzellen in den angegebenen Dosen einzusortieren. Zusätzlich sortieren Sie 10.000 Zellen in eine Vertiefung ohne normale Blutzellen und analysieren Sie erneut mithilfe von FACS, um Reinheit und Vitalität der sortierten Zellen zu überprüfen. Zentrifugieren Sie die 96-Loch-Platte bei 2000 × g für 10 Minuten, um die Zellen zu pelletieren.

Entfernen Sie 95 Mikroliter des Überstandes und resuspendieren Sie die Zellen in den verbleibenden fünf Mikrolitern. Injizieren Sie die Zellsuspension in die Bauchhöhle von syngenen Zebrafischen im Alter von mehr als 60 Tagen mit einer 26½-Gauge-Mikrospritze. Eine Anästhesie der Zebrafische vor der Transplantation ist nicht erforderlich.

Transplantieren Sie 45 Fische mit 10 Leukämiezellen, 20 Fische mit 100 Zellen, sieben Fische mit 1000 Zellen und fünf Fische mit 10.000 TALL-Zellen etwa 28 Tage nach der Transplantation. Untersuchen Sie die empfängenden Zebrabärblinge mit einem Epi-Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 485/20 und eines Emissionsfilters von 530/25, um die GFP-Fluoreszenz nachzuweisen.

Notieren Sie die Anzahl der positiven Fische pro Gesamtanzahl der injizierten Fische. Überprüfen Sie die Fische alle 14 Tage erneut, bis zu einem Zeitraum von 90 Tagen, und dokumentieren Sie die Anzahl der positiven Fische. Wenn ein tumorpositiver Fisch zahlreicher wird.

Töten Sie das Tier durch eine Überdosis an Trica US, geben Sie die Ergebnisse in eine Tabelle ein und laden Sie die Daten in die webbasierte Software für die extreme Grenzverdünnungsanalyse hoch, um die Häufigkeit selbsterneuernder Leukämiezellen innerhalb der primären TALL CG zu bestimmen. Ein Stamm von Embryonen wurde mit RAG zwei cmic injiziert, und RAG zwei GFP-Larven wurden auf primäre TALL untersucht. Nach 28 Tagen, in Übereinstimmung mit früheren Arbeiten, weisen etwa 5 % der injizierten Fische GFP-positive T-Zellen in ihrem Thymus auf, und 100 % dieser Fische entwickeln Leukämie. Hier wurden fluoreszenzmarkierte TALL-Zellen aus 65 Tage alten erkrankten Tieren sortiert und im Grenzverdünnungs-Transplantationsassay verwendet. Zunächst wurde ein Tor gezeichnet, um Einzelzellen auszuwählen.

Dann wurden Propidiumiodid-negative Zellen ausgewählt. Abschließend wurde ein Gatter erstellt, um ausschließlich die GFP-positiven Leukämiezellen für die Sortierung zu isolieren. In diesem Beispiel von T-ALL-transplantierten Fischen am Tag 28 waren frühe Tumoren als Bereich GFP-positiver Zellen in der Nähe der Injektionsstelle sichtbar.

Während einige TLS stärker fortgeschritten waren und sich bereits zur Durchführung dieser Experimente in der Bauchhöhle ausgebreitet hatten, wurden über 220 Tiere transplantiert, was von einer Person innerhalb mehrerer Stunden problemlos durchgeführt werden kann. Die Datenanalyse mit der elda-Software zeigte, dass durchschnittlich eine von 135 T-All-Zellen selbsterneuernde, Leukämie weitertragende Zellen waren. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Tumorzellen in limitierender Verdünnung in die Bauchhöhle syngener Zebrafische transplantiert werden können und wie die resultierenden Daten zur Bestimmung der Häufigkeit tumorverbreitender Zellen innerhalb eines bestimmten Tumors verwendet werden können.

Weitere Studien unter Verwendung genetisch modifizierter Tiere könnten dazu beitragen, die Mechanismen zu identifizieren, die die Selbsterneuerung dieser tumorverbreitenden Zellen steuern.