Identifikation und Analyse von Maus Erythroid Vorläufern mit dem CD71/TER119 Durchflusszytometrische Assay

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Vorläuferzellen der roten Blutkörperchen direkt in frisch gewonnenem Gewebe von Mäusen nachzuweisen. Dies ermöglicht es uns, ihre molekularen Eigenschaften während Phasen zu untersuchen, in denen das erythropoetische System dieser Mäuse Veränderungen unterliegt. Beispielsweise wird während der embryonalen Entwicklung oder als Reaktion auf hypoxischen Stress zunächst das hämatopoetische Gewebe aus der fetalen Leber der Maus oder aus der adulten Milz oder dem Knochenmark isoliert und in eine Einzelzell-Suspension dissoziiert.

Anschließend werden die Zellen mit Antikörpern gegen die Oberflächenmarker CD 71 und TER one 19 sowie mit weiteren gewünschten Markern markiert. Um beispielsweise das Zellüberleben oder den Zellzyklusstatus zu messen, wird die markierte Zellsuspension anschließend mit einem Durchflusszytometrie-Analysator untersucht, und spezifische Erythroblast-Teilpopulationen in unterschiedlichen Reifungsstadien werden identifiziert. Diese spezifischen Teilpopulationen können durch Zellsortierung angereichert werden. Danach können zelluläre und molekulare Analysen für jede Erythroblast-Reifungsstufe durchgeführt werden.

Die Möglichkeit, Erythroblasten in bestimmten Reifungsstadien direkt in frisch isolierten hämatopoetischen Geweben zu identifizieren, eröffnet uns die Chance, diese Zellen im physiologischen Kontext zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht es uns daher, Erythroblasten unterschiedlicher Reifungsstadien in vivo zu analysieren. Wenn Mäuse Reizen ausgesetzt werden, beschleunigen sie die erythropoetische Leistung.

Zum Beispiel hypoxische Bedingungen, die eine Höhenlage simulieren, oder die Injektion des Hormons Erythropoietin. Wir verwenden die mehrparametrige Durchflusszytometrie, um Erythroblasten in einem komplexen Gewebemilieu zu identifizieren und gleichzeitig deren Signalübertragung, Überlebensstatus und Zellzyklusstatus zu untersuchen. Außerdem können wir Erythroblasten in spezifischen Reifungsstadien direkt aus frischem Gewebe sortieren und deren Genexpressionsniveaus, Chromatinstatus oder andere molekulare Funktionen analysieren.

Die definitive Erythropoese der Maus findet in der Milz und im Knochenmark der adulten Maus statt. Daher werden diese Gewebe von einer euthanasierten Maus entnommen. Nach der Euthanasie wird Blut durch Herzpunktion in EDTA- oder Heparin-Blutentnahmeröhrchen gewonnen; dieses Blut wird später für die Hämatokritbestimmung, die Retikulozytenzählung oder die CBC-Analyse verwendet.

Legen Sie die entnommene Milz und den Femur in separate Röhrchen mit kaltem Färbepuffer. Halten Sie die entnommenen Gewebe nach Wunsch auf Eis. Wiegen Sie die Milz ab.

Mäuse, die eine erythropoetische Stressreaktion durchlaufen, zeigen wahrscheinlich eine signifikante Zunahme des Milzgewichts. Anschließend werden Milzzellen und Knochenmarkszellen aus den gewonnenen Geweben durch Verfahren aufbereitet, die zuvor bereits am Mausembryo demonstriert wurden. Die definitive Erythropoese findet zwischen den embryonalen Tagen 12,5 und 15,5 in der fetalen Leber statt.

Weibliche Mäuse mit zeitlich festgelegter Trächtigkeit werden zur Gewinnung von fetalen Leberzellen an den Tagen 12,5 bis 14,5 der Schwangerschaft vorbereitet. Die weiblichen Mäuse mit zeitlich festgelegter Trächtigkeit werden euthanasiert, und die Uterushörner werden in eine Petrischale mit Eis entfernt. Kaltes Kulturmedium oder Färbe-Puffer.

Ein Stereomikroskop ist erforderlich, um die fetale Leber ab dem embryonalen Tag 12,5 oder jünger zu dissezieren, um die Embryonen aus dem Uterus zu entfernen. Trennen Sie zunächst jeden Embryo vom Horn. Dann schneiden Sie vorsichtig die Wand des Uterus, um den Embryo freizusetzen, der sich in seiner Amnionhöhle befindet.

Lösen Sie vorsichtig die Amnionmembran ab. Die fetale Leber ist das größte rote Bauchgewebe, das unterhalb eines deutlich kleineren Herzens liegt. Um die fetale Leber zu präparieren, fixieren Sie den Embryo mit einer Pinzette auf beiden Seiten der Leber und schieben Sie die Leber vorsichtig aus dem Bauchraum in das Medium.

Überführte die Leber vorsichtig in ein Reagenzglas, das frisches Färbe-Puffer enthält. Nachdem alle fötalen Lebern disseziert und in ein Reagenzglas mit frischem Färbe-Puffer überführt wurden, dissoziierten die Lebern mechanisch durch Pipettieren und filtrierten die dissoziierten Zellen anschließend durch ein 40-Mikron-Nylon-Mesh-Sieb. Wuschen die Zellen zweimal durch Zentrifugation, entfernten das Überstand und resuspendierten sie in Färbe-Puffer.

Nach der zweiten Wäsche die Zellen mit Trypanblau färben und mit einem Hämozytometer zählen. Eine fötale Leber bei E 13,5 weist etwa 10 hoch 7 Zellen auf. Die Zellen für die Durchflusszytometrie in einer Konzentration von ein- bis zweimal 10 hoch 6 Zellen pro 200 Mikroliter Probe resuspendieren.

Für die Zwecke dieses Video-Protokolls wird die Antikörperfärbung für die Durchflusszytometrie nur an fetalen Leberzellen demonstriert. Beginnen Sie das Verfahren, indem Sie einen Vorzug mit primärem Antikörper zur Färbung vorbereiten, der Folgendes enthält: gereinigtes Kaninchen-IgG zur Blockade von FC-Rezeptoren in Mauszellen, CD 71 FETR one 19 PE und einen Antikörper, der gegen das Zelloberflächenprotein fast gerichtet ist. Mischen Sie die Antikörperlösung vorsichtig durch zweimaliges bis dreimaliges Umstülpen des Röhrchens, geben Sie 200 Mikroliter der vorvermischten primären Antikörperlösung zu der zuvor vorbereiteten Probe fetaler Leberzellen hinzu und pipettieren Sie sanft auf und ab, um die Zellen erneut in Suspension zu bringen.

Bereiten Sie anschließend diese sechs Kontrollzellproben vor: Eine unbehandelte Probe, bei der die Zellen im Färbe-Puffer belassen werden, um die Hintergrundautofluoreszenz der Zellen bereitzustellen; eine Einzelfarbe für jeden im Protokoll verwendeten Antikörper oder Farbstoff zur Korrektur der spektralen Übersprechen zwischen den Kanälen – in diesem Experiment sind dies TUR one 19 PE CD 71 fz fast, Biotin und Streptavidin A PC sowie sieben A A DA; sowie eine Fluoreszenz-minus-einer-Kontrolle für fast biotin, die das tatsächliche Hintergrundsignal für diesen Kanal liefert, wobei die Zellen mit allen Farbstoffen oder Antikörpern des Protokolls außer fast biotin gefärbt werden. Inkubieren Sie die Probe und die entsprechenden Kontrollen mit dem primären Antikörper in der Färbelösung 45 Minuten bis eine Stunde lang auf Eis im Dunkeln.

Am Ende der Inkubation die Zellen waschen, indem drei Milliliter Färbe-Puffer zu jedem Probenröhrchen gegeben werden, und drei bis fünf Minuten bei etwa 400 × g bei vier Grad Celsius zentrifugiert wird. Anschließend das Streptavidin-PC auftragen und die Röhrchen 30 bis 45 Minuten auf Eis inkubieren. Nach Beendigung der Inkubation die Zellen wie nach der ersten Antikörperfärbung waschen.

Resuspendieren Sie die Zellen abschließend in einer Färbungslösung, die den zellunpermeablen DNA-Farbstoff seven a a d enthält, um tote Zellen auszuschließen. Die Proben sind nun bereit für die Durchflusszytometrie-Analyse. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist die korrekte Gating-Analyse der durchflusszytometrischen Ereignisse, die eine zuverlässige Identifizierung der Erythroblast-Teilpopulationen ermöglicht.

Es erfordert eine sorgfältige Geräteeinrichtung, alle korrekten Kontrollproben, eine sorgfältige Kompensation für spektrale Überlappung sowie nachfolgende Gating-Schritte, die tote Zellen, Aggregate und sehr kleine Ereignisse ausschließen. Zu Beginn der Datenanalyse werden die unbehandelte Probe und die Einzelfarben-Kontrollproben verwendet, um die Kompensation für die spektrale Überlappung für jede Farbkombination einzurichten.

In diesem Beispiel zeigen wir, wie die Fluoreszenz von FITC in den PE-Kanal übertritt und wie diese spektrale Überlappung nach Kompensation korrigiert wird. Zunächst definieren wir anhand der unbehandelten Kontrolle einen FITC-positiven und PE-negativen Bereich. Anschließend können wir mithilfe der einfarbigen FITC-Kontrolle die spektrale Übersprechen in den PE-Kanal visualisieren.

Nach der digitalen Kompensation mit der FlowJo-Software wird das Übersprechen des E-Signals in den PE-Kanal minimiert. Anschließend können tote Zellen, Aggregate und kleine Ereignisse entfernt werden. Aggregate und Zelldoubletts werden durch Auftragen der Vorwärtsstreuungshöhe gegen die Vorwärtsstreuungsfläche und Auswahl der Ereignisse innerhalb eines schmalen diagonalen Tors eliminiert.

Tote Zellen werden entfernt, indem Zellen ausgewählt werden, die negativ für DAPI, einen zellunpermeablen DNA-Farbstoff, sind. Das lebensfähige Zelltor, das DAPI-negativ ist, schließt außerdem sehr kleine Ereignisse wie Zellkerne oder Trümmer aus, die einen sehr geringen Vorwärtsstreulichtsignal aufweisen. Als Nächstes zeigen wir die Torgate-Strategie für fetale Leberzellen.

Frisch geerntete Zellen wurden für CD71 TUR eins neunzehn und einen Cocktail aus ZI-markierten Antikörpern, die gegen nicht-erythroide Linienmarker gerichtet sind, markiert. In diesem Beispiel wurden die Proben bereits auf spektrale Überschneidungen kompensiert und anschließend gegated, um Aggregate, tote Zellen und sehr kleine Ereignisse auszuschließen. Wir verwenden die FMO-Probe, die alle Farben außer dem linienpositiven Fitzy-Färbemittel enthält, um ein Fitzy-Histogramm darzustellen und das liniennegative Zellgatter zu definieren. Anschließend wenden wir dieses Gatter auf die fetale Leberzellprobe an, die mit ZI-konjugierten Linienmarkern gefärbt wurde.

Linien-negativen Zellen werden ausgewählt und mit CD71 auf der Y-Achse und TER119 auf der X-Achse dargestellt. Auf der A-Achse sind die Zellen nun bereit, in die Teilpopulationen S0 bis S5 unterteilt zu werden. Die linienabgereicherte S0-Teilpopulation enthält überwiegend Zellen mit CFU-E-Potential vor dem Einsetzen der EPO-Abhängigkeit.

Die S1-Teilmenge enthält EPO-abhängige CFU-E-Zellen, die sich weitgehend in der S-Phase des Zellzyklus befinden. Die Zellen der S2-Teilmenge haben das Kolonie-bildende Potenzial verloren und beginnen, Hämoglobin zu exprimieren. Die Zellen der S3-Teilmenge sind überwiegend basophile Erythroblasten. Die S4- und S5-Teilmengen enthalten späte Erythroblasten. Dargestellt ist hier die Analysestrategie nach der Datenerfassung von Milzzellen, die verarbeitet und mit Antikörpern gegen CD71 und TER-119 sowie mit dem Markierungsfarbstoff für den Apoptoserezeptor gefärbt wurden.

Im ersten Diagramm sind alle erfassten Ereignisse dargestellt, wobei das diagonale Tor jene Ereignisse umfasst, die wahrscheinlich einzelne Zellen darstellen, und Doppelzellen oder größere Aggregate ausgeschlossen sind. Die Zellen innerhalb dieses Tores werden im zweiten Histogramm weiter analysiert. Sehr kleine Ereignisse, die vermutlich Kernen oder Zerfallsprodukten entsprechen, werden ausgeschlossen.

Die gegebenen Zellen werden im dritten Histogramm dargestellt, wobei DAPI-positive Zellen, die vermutlich membranpermeable apoptotische Zellen sind, von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden. Histogramm vier zeigt die resultierende Population an vitalen Milzzellen. Im pro-eGate befinden sich CD71-hohe, TER119-intermediäre Zellen; die R119-hohen Zellen werden im fünften Histogramm weiter analysiert.

Hier werden CD71-hohe Zellen in weniger reife, großflächige A-Erythroblasten und kleinere, reifere AB-Erythroblasten unterteilt. Die am weitesten entwickelte Erythroblast-Teilpopulation ist ARI C. Die Expression von Zelloberflächenproteinen kann gleichzeitig für jede dieser Teilpopulationen gemessen werden, indem die entsprechenden Antikörper zeitgleich mit TER1-19 und CD71 zugegeben werden. Das Färbungshistogramm sechs zeigt die Expression des Todesrezeptors Fas an der Zelloberfläche spezifisch in der A-Teilpopulation bei Mäusen im Grundzustand und bei Mäusen, die eine Einzeldosis von Epo erhalten haben.

Die Ergebnisse zeigen, dass EPO die schnelle Expression in diesem Bereich unterdrückt. Eine Populationsanalyse der in vivo-Expression intrazellulärer Proteine oder des Zellzyklusstatus kann ebenfalls für Zellen in jeder Teilpopulation durchgeführt werden. In dieser repräsentativen Zellzyklusanalyse erhielten Mäuse eine intraperitoneale Injektion von BRDU, und das Knochenmark wurde 30 bis 60 Minuten später entnommen.

Neben der Färbung für CD71 und TER119 wurden die Zellen auch auf die Einlagerung von BrdU in ihre replizierende DNA untersucht; BrdU-positive Zellen befinden sich in der S-Phase des Zellzyklus. Interface-Zellen sind BrdU-negativ und können in die G1- oder G2/M-Phasen differenziert werden. Mithilfe von DNAD7 können die Zellen aus jedem der PRO-E-, Area A-, B- und AEC-Teilmengen sortiert werden.

Hier sind sie in Cytosin-Präparationen dargestellt, die eine schrittweise Reifung mit abnehmender Zellgröße, Kernkondensation und zunehmender Braunfärbung zeigen, was der Hämoglobinsynthese entspricht. Schließlich wird hier eine repräsentative Zellzyklusanalyse der S3-Teilpopulation in der fetalen Leber von E 13,5 gezeigt. Schwangere Mäuse erhielten eine Injektion mit BRDU.

Fetale Lebern wurden 30 bis 60 Minuten später entnommen, fixiert, permeabilisiert und mit Antikörpern gegen CD71, TER119 und BrdU gefärbt. Der Zellzyklusstatus von S3-Zellen wird analysiert, wobei sich S-Phasen-Zellen in der BrdU-positiven Population befinden, und der DNA-Gehalt wird durch Färbung mit dem DNA-Farbstoff 7-AAD quantifiziert.

Der von uns beschriebene zytometrische Ansatz ermöglicht die gleichzeitige Untersuchung zellulärer Funktionen wie der Expression von Oberflächenmarkern und anderen Proteinen, des Zellüberlebens, der Zellsignaltransduktion mithilfe fosso-spezifischer Antikörper sowie des Zellzyklusstatus. Dadurch können wir die molekularen Reaktionen von Erythroblasten in unterschiedlichen Reifungsstadien auf eine breite Palette von Stimuli oder die Wirkung genetischer Mutationen untersuchen. Es ist darauf hinzuweisen, dass die durchflusszytometrischen Reifungsteilpopulationen anhand der Expression von Oberflächenmarkern und des Vorwärtsstreulichts definiert werden.

Wir stellten fest, dass im Allgemeinen die Zellen in jeder Teilpopulation ähnlichen morphologischen Erythroblastenstadien in einer Vielzahl von Mausmodellen entsprechen. Wir empfehlen jedoch, dies zu überprüfen, wenn ein neues Mausmodell untersucht wird. Durch die Sortierung von Zellen aus jeder Teilpopulation und die Untersuchung ihrer Morphologie können die Zellen aus jeder Teilpopulation außerdem für eine RNA- oder Transkriptom-Analyse sortiert werden. Sortierexperimente sollten niedrige Sortierdrücke und weite Düsen verwenden, um die Scherbelastung auf die Zellen zu minimieren.

Wir empfehlen außerdem, nach jedem Sortierversuch die Zellreinheit und -viabilität zu überprüfen. Schließlich ist es bei dem Nachweis einer Veränderung der Häufigkeit einer bestimmten Teilpopulation wichtig zu bestimmen, ob diese auf eine tatsächliche Änderung der Zellanzahl innerhalb dieser Teilpopulation zurückzuführen ist oder ob sie durch Veränderungen in anderen Teilpopulationen verursacht wird. Daher ist es zusätzlich zur Bestimmung der Häufigkeiten von Teilpopulationen stets notwendig, auch die absolute Zahl der Zellen in jeder Teilpopulation zu ermitteln.