Mosaic Analyse der Genfunktion in Postnatale Mäusehirnen mithilfe von Virus-basierten Cre Rekombination

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Genfunktion während der postnatalen Phase der Gehirnentwicklung zu beeinflussen. Dies wird erreicht, indem zunächst die geeigneten Viren ausgewählt und vorbereitet, in die Spritze gefüllt und die Injektionsausrüstung vorbereitet werden. Anschließend werden die Viren in die Gehirne neugeborener Mäusewelpen injiziert, und der letzte Schritt besteht darin, die Tiere zu töten und die injizierten Bereiche abzubilden.

Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die eine differenzielle Markierung von Kontroll- und Knockout-Zellen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie zeigen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, beispielsweise wie die Phase der postnatalen Entwicklung genetisch reguliert ist. Für die Injektion kann eine kommerziell erhältliche Lösung eines adeno-assoziierten Virus in voller Titer verwendet werden, typischerweise 10 zur 12. Genomkopien pro Milliliter, um eine große Anzahl von Zellen zu manipulieren.

Wenn eine geringe Dichte oder Markierung gewünscht ist, beginnen Sie mit einer Verdünnung von 1 zu 10. Nach dem Auftauen des Virus auf Eis überführen Sie sofort das Vorverdünnungsvolumen in ein steriles 250-Mikroliter-PCR-Röhrchen. Halten Sie die Verdünnung auf Eis.

Bereiten Sie die Injektionspumpe vor, indem Sie eine geeignete Spritze auswählen und sie mit einer Ladekanüle verbinden. Ziehen Sie anschließend vorsichtig die Viruslösung auf, bis eine sehr kleine Luftblase in der Spritze sichtbar ist; zur Erleichterung dieses Schritts kann ein inerter Lade-Farbstoff verwendet werden. Befestigen Sie nun die Spritze mit einem Halter an der Pumpe.

Verbinden Sie dann vorsichtig das Verbindungsrohr zwischen der Spritze und dem Nadelhalter. Achten Sie darauf, dass die Injektionsnadel direkt mit dem Verbindungsrohr im Inneren des Nadelhalters in Kontakt steht. Bewegen Sie nun langsam die Lösung durch das Verbindungsrohr, bis ein winziger Tropfen der Lösung an der Nadelspitze sichtbar ist.

Befestigen Sie den Kolben vorsichtig neben dem Schieberblock mit einer Halterung an der Pumpe. Stellen Sie die Injektionsrate auf acht Mikroliter pro Minute ein und legen Sie das Injektionsvolumen zwischen ein und zwei Mikroliter fest. Passen Sie anschließend die Einstellung des Pumpenspritzen-Durchmessers an den Durchmesser der verwendeten Spritze an.

Zuletzt die Welpen während der Erholungsphase schützen, indem man die Heizplatte auf 38 Grad Celsius einstellt und mit einem Papiertuch bedeckt. Unter Verwendung eines IACUC-genehmigten Protokolls P-null- oder P-eins-Mauswelpen für die Injektion vorbereiten, indem man sie einer Kälteanästhesie unterzieht. Einige Papiertücher mit Wasser befeuchten und auf Eis legen.

Danach vier oder fünf Welpen auf das Papiertuch legen, gut voneinander getrennt. Das Papiertuch vorsichtig über die Welpen falten, eine kleine Menge zerstoßenen Eises auf das Papiertuch geben und die Welpen etwa fünf Minuten lang inkubieren. Die Welpen können bis zu 15 Minuten sicher auf Eis gehalten werden und erholen sich dennoch gut.

Positionieren Sie nun ein anästhesiertes Welpen auf einem Montageblock, um optimalen Zugang zur Injektionsstelle zu erhalten. Der Cortex lässt sich beispielsweise am einfachsten erreichen, indem das Tier flach auf dem Bauch liegt. Das Welpen kann mit einem Pflaster fixiert werden; halten Sie den Kopf manuell stabil und ziehen Sie die Haut straff, um Bewegungen zu verhindern.

Navigieren Sie dann anatomische Landmarken des Schädels wie die Lambda-Naht und wählen Sie mit der anderen Hand einen reproduzierbaren Injektionspunkt aus. Führen Sie die Nadel vorsichtig durch den Schädel ein. Üben Sie keinen starken Druck aus, wenn die Nadel nicht leicht in den Schädel eindringt. Positionieren Sie stattdessen die Nadel neu und versuchen Sie es erneut, indem Sie sanft vorgehen.

Die Injektionstiefe variiert je nach Individuum und Stamm leicht für den Kortex; in der Regel eignet sich eine Tiefe von einer halben bis einem Millimeter. Injizieren Sie nun die Viruslösung, wobei ein Kollege die Pumpe aktiviert, um Handbewegungen zu minimieren. Ideal wäre es, ein Fußpedal zu verwenden, um die Pumpe nach der Injektion zu starten.

Halten Sie die Nadel einige Sekunden lang an Ort und Stelle, während Sie den Kopf des Welpen ruhig halten. Ziehen Sie die Nadel dann langsam heraus. Lassen Sie den Welpen nun fünf bis zehn Minuten lang auf der abgedeckten Heizplatte ausruhen.

Währenddessen andere Welpen weiter injizieren. Wenn alle Welpen ihre rosa Färbung zurückgewonnen haben und sich alle bewegen, sie vorsichtig mit einem Teil ihres Heimbettes abreiben. Erst danach können sie zu ihrer Mutter zurückgebracht werden.

Andernfalls könnten sie als fremde Welpen behandelt werden, die die Mutter höchstwahrscheinlich töten würde, nachdem die Welpen zu ihr zurückgebracht wurden. Reinigen Sie die Injektionsvorrichtung, indem Sie die Spritze vollständig mit Aceton oder 70 %igem Ethanol füllen. Falls acetonempfindliche Komponenten wie Sano, Acruate oder Klebstoffe verwendet werden, spülen Sie die Lösung mehrmals durch die Injektionsvorrichtung, wobei jedes Mal frische Lösung verwendet wird.

Dadurch werden restliche Virenlösungen entfernt, und die Lösungsmittel verdampfen. Nach dem Durchspülen der Apparatur desinfizieren Sie den Arbeitsbereich mit Bleichmittel, damit dieser für den nächsten Experimentator bereit ist. Mentor. Die erfolgreiche Technik führt zu einer starken neuronalen Infektion an der Injektionsstelle.

Injektionen in spezifische Regionen wie die Großhirnrinde und den oberen Hügel sind typischerweise mit lokalen Infektionen verbunden, die sich nur geringfügig auf benachbarte Bereiche ausbreiten. Die Verwendung einer Viruslösung mit hoher Titer erhöht die Wahrscheinlichkeit einer Infektion benachbarter Areale wie des Hippocampus im Vergleich zur Injektion einer Viruslösung mit niedrigem Titer. Dies führt typischerweise zu einer spärlichen Infektion in der Nähe der Injektionsstelle; wie beispielsweise bei einer zerebellären Injektion mittig entlang der Mittellinie sollte die Anzahl infizierter Zellen mit dem Titer der injizierten Viruslösung korrelieren.

Beispielsweise führt die Injektion eines Gemischs aus hochtitrigen Lösungen zweier R AAV acht Viren, die unterschiedliche fluoreszierende Proteine exprimieren, in den Kleinhirnbereich zu einer Infektion vieler Kinji-Zellen, die unterschiedlich markiert sind. Umgekehrt kann die Injektion einer niedrigtitrigen Viruslösung zu einer spärlichen Infektion führen, was die Visualisierung einzelner Zellen erleichtert. Fluoreszenzmarkierte Neuronen können direkt in frisch geschnittenem lebendem Gewebe beobachtet werden oder sie können einer Immunfärbung unterzogen werden.

Dies verstärkt die endogenen fluoreszenten Signale für die spätere Bildaufnahme mittels Fluoreszenzmikroskopie mit großem Sichtfeld oder konfokaler Fluoreszenzmikroskopie. Schließlich ist RAAV acht in der Lage, eine Vielzahl von Neuronentypen in der Hirnrinde zu infizieren und dabei feine Fortsätze stark zu markieren. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung in etwa 30 Minuten durchgeführt werden.